原代细胞的背景与应用及研究动态！

一、背景

原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株（系）研究、DNA，RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。原代细胞在生物医药领域有不可替代性作用，市场前景广阔。

原代细胞的培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。

最常用的原代细胞的培养有组织块培养和分散细胞培养。

组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。

分散细胞培养大致步骤为：将动物组织从机体中取出离散成单个细胞(常用胰蛋白酶)，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖(注意整个过程无菌)。

二、应用

原代细胞可以用于瓦氏雅罗鱼鳃、肠组织及原代细胞在碱胁迫下的钙调蛋白表达机制研究：

以耐高碱自然优势种瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)作为研究对象,建立鱼体鳃、肠细胞的原代及传代培养体系,探究碱胁迫对瓦氏雅罗鱼原代鳃、肠细胞的增殖能力及功能的影响,同时分析了钙调蛋白(Calmodulin,CAM)在鳃、肠组织及细胞中的表达情况,从而在瓦氏雅罗鱼碱耐受机制角度达到对钙调蛋白作用机理的初步分析。基于此,本研究主要评估了瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞对急、慢性碱耐受性及鳃、肠组织的生长发育状态,观察了碱胁迫下瓦氏雅罗鱼血清中Ca2+含量,从而对钙调蛋白的基因表达量变化进行生理到组织再到细胞的多层次解读。

本研究采用胰蛋白酶消化法和密度梯度离心法对鳃、肠细胞进行分离、纯化后,将细胞悬液均分置于DMEM(Dulbecco’s Modified Eagles Medium)、MEM(Minimum Essential Medium)和L-15(Leibovitz Medium)三种培养基中进行细胞培养实验。在该过程中,分时段分别采用血细胞计数板测定细胞增殖数,用细胞计数法测定细胞增殖率;同时,对其进行细胞来源和活性鉴定,分析原代鳃、肠细胞的生长状态。

1、通过对两细胞系进行长期培养和形态学观察后发现:瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞原代培养时采用DMEM培养基可获得稳定、良好的培养效果,细胞生长状态显著优于L-15和MEM;启动原代培养的36-72 h,鳃、肠细胞生长代谢旺盛,其增殖规律符合经典“S”生长曲线;利用钙调蛋白camk2g2基因(Locus Tag Prefixes:J5810)可在全身表达的特点进行细胞来源鉴定后证实：两细胞确系分离自瓦氏雅罗鱼。

2、碱胁迫对瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞活性及功能的影响为探讨碱胁迫对瓦氏雅罗鱼原代鳃、肠细胞活性及功能的影响,本研究建立瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞体外培养模型,采用NaHCO3作为主要耐受因素。实验过程如下:加入10 mmol/L NaHCO3的新鲜DMEM培养基于CO2培养箱中孵育1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后收集在660 nm(双波长法)处检测其吸光值,制作标准曲线确定波动范围以方便后续碱梯度实验指标测定。

随后根据上述实验结果:设置NaHCO3浓度梯度分别为0、2.5、5、7.5、10、12.5、25、50和75 mmol/L对鳃、肠细胞系进行耐受,然后将其放入CO2培养箱中孵育3 h后,采用CCK-8法检测两细胞活性和存活率;DNA Ladder法测定鳃、肠细胞细胞凋亡及坏死情况,从而分析细胞生长代谢状态。结果显示:瓦氏雅罗鱼鳃、肠细胞的最佳耐受时长为3h,耐受NaHCO3的最佳浓度为25～50 mmol/L;该条件下孵育的鳃、肠细胞均出现细胞凋亡特征。上述实验表明:瓦氏雅罗鱼体外培养鳃、肠细胞可耐受25～50 mmol/L NaHCO3高浓度碱生境,且该生存条件对两细胞系的功能及活性皆可造成不同程度的细胞凋亡现象。

3、钙调蛋白对瓦氏雅罗鱼鳃、肠组织及细胞功能的影响本部分实验分为组织学及细胞学两个层次。

体外实验:以瓦氏雅罗鱼原代鳃、肠细胞为实验对象,选取3个NaHCO3浓度(0、25和50 mmol/L)进行梯度耐受,经3 h孵育后通过测定原代细胞胞内Ca2+含量、camk2g2基因、内质网应激反应关键基因xbp1u与氧化应激反应关键基因gsr表达量,来探讨离体条件下碱胁迫对瓦氏雅罗鱼钙调蛋白camk2g2的影响,并在细胞层面上探究该作用机制与非生物胁迫因子应激响应机制之间的潜在关联。结果显示：3 h碱耐受条件下,camk2g2在25 mmol/L NaHCO3耐受的鳃细胞中出现极显著表达(<0.01),50 mmol/L NaHCO3耐受的鳃细胞中则出现显著性上升(<0.05),但camk2g2在肠细胞中的表达量虽然随着碱度的增加而增加,但未见显著差异(>0.05)。

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