P388小鼠白血病细胞的复苏与传代及应用！

一、背景

P388小鼠白血病细胞来源于ATCC细胞库是经永生化处理的小鼠白血病细胞株。

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。

白血病细胞就是异常增生的白细胞，主要是由于造血干细胞的恶性克隆性疾病，克隆性的白细胞，因为增殖失控，分化障碍还有凋亡受阻的机制，在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并且浸润其他的非造血组织和器官，同时抑制正常的造血功能。临床上可以出现不同程度的贫血，出血，感染发热以及肝脾淋巴结的肿大和骨骼的疼痛。

二、细胞相关操作

细胞复苏：

1、37°C水浴预热培养基（RPMI1640+10S）；

2、从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；

3、在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；

4、弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀；

5、置于37°C，5%CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话，瓶盖不要拧太紧)；

6、第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。

细胞传代：

1、当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；

2、37°C水浴预热培养基（RPMI1640+10S）；

3、在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞；

4、显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基（RPMI1640+10S）终止消化；

5、用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散；

6、将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；

7、弃上清，加入15-20ml的培养基（含血清）重悬细胞后转入T75培养瓶中或按适当比例传到T25瓶中（确保细胞贴壁后融合度在25-50%之间），细胞密度在1×104 cells/cm2(2.5×105 cells/T-25瓶），混匀细胞悬液，确保细胞均匀分布；

8、将培养瓶置于37°C，5%CO2的无菌培养箱中培养。

三、应用

用于小鼠骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖的影响研究：

体外观察小鼠骨髓间充质干细胞及其培养上清对白血病细胞增殖的影响;观察小鼠骨髓间充质干细胞在体外对CTL杀伤白血病细胞的影响。

方法：

1、MTT法检测mMSC及其培养上清对同基因和异基因来源的白血病细胞增殖的影响。

2、MTT法检测同基因mMSC对CTL杀伤FBL3细胞的影响。

结果：

1、骨髓来源的mMSC及其培养上清在体外对FBL3和P388细胞的增殖起抑制作用,随着mMSC数量的增加,抑制作用增强。细胞周期检测表明共培养后的FBL3和P388处于G0/G1期的细胞显著增多。

2、小鼠骨髓单个核细胞体外培养可以获得大量DC,致敏DC刺激淋巴细胞后产生CTL。

3、mMSC在体外对CTL杀伤FBL3细胞起促进作用。

结论：mMSC及其培养上清在体外能够抑制同基因和异基因来源的小鼠白血病细胞的增殖,并能促进CTL对白血病细胞的杀伤。