人甲状腺过氧化物酶(TPO)ELISA试剂盒的应用!
(2023-02-11 10:41:46)
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知识教育应用 |
分类: 百欧博伟生物 |
一、背景
人甲状腺过氧化物酶(TPO)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人甲状腺过氧化物酶(TPO)的含量。
检测原理:试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被人甲状腺过氧化物酶(TPO)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人甲状腺过氧化物酶(TPO)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
二、样品收集、处理及保存方法
1、血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2、血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3、细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4、组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
三、操作步骤
1、从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4。
2、设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
3、待测样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;
4、随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37水浴锅或恒温箱温育60min。
5、弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6、每孔加入底物A、B各50μL,37避光孵育15min。
7、每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
四、结果判断
绘制标准曲线:在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。
五、应用
用于定量检测人甲状腺过氧化物酶抗体的荧光酶免疫法的建立及临床应用研究:
利用分子生物学方法在原核系统表达hTPO抗原决定簇片段,以基因工程产品为抗原,建立定量检测hTPOAb的FEIA,并用于临床作为AITD的诊断、鉴别诊断和疗效监测手段。
方法:在表达菌株E.Coli BL21中诱导表达含有本室构建的hTPO抗原决定簇“热点”区基因(1702-2622,编号相对于起始密码,编码AA568-874)的重组表达质粒pGESJ,经纯化获得GST-hTPO(谷胱甘肽巯基转移酶-人甲状腺过氧化物酶)融合蛋白,并对其进行分子量和免疫活性鉴定。以重组融合蛋白GST-hTPO为抗原包被96孔透明板,样品血清中hTPOAb为一抗,碱磷酶标记的羊抗人IgG为二抗,4-MUP(4-甲基磷酸伞形酮)为荧光底物建立了板式FEIA,利用经国内标准品校正的本室标准物建立标准曲线以实现本法的定量检测,并对本法的特异性、精密度、准确度、健全性等进行了方法学鉴定。
用该法测定262例正常人,五类甲状腺疾病患者534例,包括Graves’病(GD)270例,桥本氏病(HT)166例,单纯甲肿43例,亚甲炎38例,腺瘤17例。
结果:1.GST-TPO融合蛋白的表达、纯化及鉴定以E.Coli BL21为表达菌株,以IPTG(isopropylβ-D-thoiglactoside,异丙基β-D-硫代半乳糖苷)为诱导剂,浓度0.1mM,25诱导5.5小时,产物经Glutathione Sepharose 4B(谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B)亲和层析纯化后,使用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳)测定GST-hTPO分子量结果为61.24KD,经考马斯亮蓝染色法定量获得融合蛋白表达产率为12mg/L培养基,FEIA结果证明GST-hTPO具有良好免疫活性。将包被GST-hTPO并封闭的透明板条冻存于-80冰箱,以ELISA进行6个月的观察,得到阴性、阳性批间变异系数分别为12.30%和6.78%。
2. 以融合蛋白为抗原建立定量荧光发光酶免疫分析技术并进行方法学鉴定反应条件的优化:按交叉连续稀释法组合包被抗原量,人血清稀释倍数,二抗稀释倍数,结果在不同条件组合中当包被抗原量为1μg/孔,人血清稀释倍数为1:100,二抗稀释倍数为1:20000时,37温育60分钟时阳性血清与阴性血清的差距可达到10倍,故选作最佳条件。最后加入终止液EDTA反应达到平衡后测量。确定的标准曲线六个点的浓度分别为180 IU/ml,100 IU/ml,17 IU/ml,6 IU/ml,3 IU/ml及2IU/ml。
方法学鉴定,特异性:该融合蛋白与甲状腺球蛋白抗体无交叉反应;精密度:取阳性、阴性对照血清各六孔测定得到批内变异分别为5.14%、19.36%,两个月内测定六次阳性、阴性对照血清得到批间变异分别为6.72%、17.90%;准确度:测定高、中、低样品回收率分别为102%、92%、100%;健全性:将一份HT患者血清分别进行两次对倍稀释,以测定的三个浓度值绘制成稀释曲线,得到的稀释曲线与标准曲线基本平行;相关性:将本法与雅培公司AXSYM System hTPOAb试剂盒共同检测61份血清,结果显著相关R=0.80,P<0.01。
3.临床应用经测定262例健康人血清,得到hTPOAb阳性切线值为5IU/mL。用此方法测定病人血清hTPOAb,测定甲状腺疾病患者hTPOAb以中位数表示,HT为11.5IU/ml,阳性率89.76%;GD治疗前是4IU/ml,阳性率32.35%;GD治疗后是4IU/ml,阳性率31.68%;亚甲炎组为4IU/ml,阳性率26.32%:单纯甲肿为3IU/ml,阳性率为0;腺瘤为4IU/ml,阳性率11.76%。HT患者血清hTPOAb阳性率与其它各组有显著差异(p<0.01)。