人胎盘绒毛癌细胞的培养步骤与应用！

一、背景

人胎盘绒毛癌细胞是来源于男性胎儿胎盘滋养层肿瘤的绒毛绒膜癌，形态上皮细胞样贴壁细胞。

二、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备培养基；北美胎牛血清，10%；双抗1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

2、细胞处理：

（1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

（2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

1.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

2.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

3.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

（3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

三、应用

用于趋化因子CXCL12和受体CXCR4/CXCR7在植入性胎盘组织中的表达及其作用机制研究：

沉默/过表达CXCL12,CXCR4和CXCR7基因对滋养细胞的调控作用目的探讨沉默/过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后对绒毛外滋养细胞株HTR-8/SVneo和人胎盘绒毛癌细胞株JAR增殖、迁移侵袭、细胞凋亡生物学功能的影响。

方法：

1)利用慢病毒介导RNA干扰/过表达技术,将shRNA或CXCL12、CXCR4和CXCR7基因导入绒毛外滋养细胞株HTR-8/SVneo和人胎盘绒毛癌细胞株JAR中,经过抗性筛选,建立稳定沉默和稳定过表达的单克隆滋养细胞株；

2)应用实时荧光定量RT-PCR及Western Blot法检测沉默/过表达效果；

3)CCK8试验检测细胞増殖；

4)划痕实验检测细胞迁移能力；

5)Transwell侵袭试验检测细胞侵袭能力；

6)流式细胞技术检测细胞凋亡。

结果：

1)成功构建稳定沉默或过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7蛋白的滋养细胞株,分为沉默组:HTR-8/SVneo和JAR/sh CXCL12、HTR-8/SVneo和JAR/sh CXCR4和HTR-8/SVneo和JAR/sh CXCR7;表达组:HTR-8/SVneo和JAR/OE-CXCL12、HTR-8/SVneo和JAR/OE-CXCR4和HTR-8/SVneo和JAR/OE-CXCR7;过表达阴性对照组（过表达空载转染）;沉默阴性对照组（sh空载转染）和空白对照组。

2)过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后HTR-8/SVneo和JAR细胞增值率明显升高（P<0.05）,抑制CXCL12、CXCR4和CXCR7基因HTR-8/SVneo和JAR细胞增值率明显下降（P<0.05）；

3)过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后细胞迁移距离明显增加（P<0.05）,抑制CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后细胞迁移距离明显减少（P<0.05）；

4)过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后细胞穿过人工基底膜的数量增加（P<0.05）,抑制CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后细胞穿膜数减少（P<0.05）;过表达或抑制CXCL12、CXCR4和CXCR7后细胞凋亡数无改变增多（P>0.05）。

结论：在体外细胞实验中,趋化因子CXCL12及受体CXCR4/CXCR7均参与了滋养细胞增殖、迁移侵袭的调控,因此CXCL12、CXCR4和CXCR7在胎盘植入绒毛过度侵袭中发挥着重要的作用。

探讨趋化因子CXCL12和受体CXCR4/CXCR7影响滋养细胞侵袭能力的分子机制目的通过调控CXCL12、CXCR4和CXCR7基因水平,检测HTR-8/SVneo和JAR细胞Rho A、Rac1和Cdc42蛋白水平变化以及Rho/Rock、PI3K/AKT信号通路的活化情况,进一步探讨CXCL12、CXCR4和CXCR7影响滋养细胞侵袭能力的可能机制。

方法：1)应用Western blot检测沉默/过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后HTR-8/SVneo和JAR细胞Rho A、Rac1和Cdc42蛋白水平;2)Western blot检测沉默/过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后HTR-8/SVneo和JAR细胞Rho/Rock、PI3K/AKT信号通路蛋白表达及磷酸化;3)在稳定过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7基因的HTR-8/SVneo和JAR细胞株中加入Rock抑制剂Y-27632或PI3K抑制剂NVP-BEZ235,Transwell侵袭试验检测细胞侵袭能力。

结果：1)沉默或过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7的表达水平可以抑制或上调HTR-8/SVneo和JAR细胞Rho A、Rac-1和Cdc42蛋白的表达;2)沉默或过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7的表达水平可以抑制或上调HTR-8/SVneo和JAR细胞Rho/rock通路上rock和磷酸化肌球蛋白轻链（MLC）以及PI3K/AKT通路上磷酸化AKT蛋白表达;3)用Rho/Rock、PI3K/AKT信号通路抑制剂后,过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7的HTR-8/SVneo和JAR细胞侵袭能力减弱。结论CXCL12、CXCR4和CXCR7通过调控下游Rho/rock、PI3K/AKT信号通路上MLC和AKT蛋白的磷酸化活化,以及下游蛋白Rho A、Rac1和Cdc42抑制或增强HTR-8/SVneo和JAR细胞的侵袭能力。