HUTU-80细胞的培养步骤与应用！

一、背景

HUTU-80细胞是来自一位53岁十二脂肠腺癌患者的上皮细胞样贴壁细胞，每个HuTu-80细胞上，蛙皮素受体的位点多达6000个。生长培养基 MEM＋10S＋1%P/S，培养条件气相：空气，95%；CO2，5%温度：37。

二、培养步骤

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

三、应用

用于蓖麻毒蛋白诱导HuTu-80细胞凋亡的比较蛋白质组学研究：

蓖麻毒素是蓖麻籽中存在的一种能使核糖体失活的高效蛋白质,并由A、B链构成,A链是具有N-糖苷酶活性的活性链,导致蛋白质的合成受到抑制,引发细胞死亡；B链具有凝集素活性,能够识别和结合细胞表面含有半乳糖结构的受体,协助A链进入细胞。

当一个蓖麻毒素分子进入到细胞内时,就可以使整个细胞的蛋白质合成停止最终导致细胞死亡。

研究通过比较蛋白质组学的研究手段,用蓖麻毒蛋白诱导人十二指肠腺癌细胞（HuTu-80）,分析全蛋白差异表达的情况,为蓖麻毒蛋白在HuTu-80细胞中的作用机理提供新的试验窗口。

1、研究首先采用硫酸铵盐析法,从蓖麻种籽中提粗素,通过Sepharose4B柱亲和层析和Sephacryl S-200柱凝胶过滤层析对其进行纯化,经p-巯基乙醇处理,可见A链分子量为28KDa,B链的分子量为32KDa的蓖麻毒素。SDS-PAGE鉴定纯化后的蓖麻毒素达到了电泳纯。测定其浓度后,用获得的蓖麻毒蛋白对HuTu-80细胞进行ICso试验。结果表明：细胞形态发生变化,而IC50为200ng/ml。

2、构建蓖麻毒蛋白诱导HuTu-80细胞的凋亡模型,通过MTT排除试验、AO/EB染色、Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡,确定蓖麻毒蛋白诱导HuTu-80细胞早期凋亡时相,提取细胞组分蛋白进行Western-blot分析,观察HuTu-80细胞在凋亡过程中细胞色素c的迁移情况。结果表明：蓖麻毒蛋白对HuTu-80细胞的增殖和生长有明显的抑制作用,IC50为200ng/ml,最佳攻毒时间为8h,同时HuTu-80细胞的形态特征与生物化学特征也发生了一系列的变化,细胞核出现皱缩和破裂的情况,释放出致密颗粒状凋亡小体,细胞膜上的磷脂酰丝氨酸出现外翻,而细胞色素c随着蓖麻毒蛋白处理时间的增加,从线粒体易位到细胞浆逐渐显著。

3、用蓖麻毒蛋白浓度为200ng/ml,时间为8h处理细胞,分别提取正常组和处理组的HuTu-80细胞全蛋白,iTRAQ同位素标记技术与质谱检测技术得到1660个蛋白信息,其中采用假设检验的方法对蛋白质定量结果进行差异分析,选取p-value<0.05的蛋白质作为差异蛋白质,共的到94个差异蛋白质,这为以后研究蓖麻毒蛋白诱导HuTu-80细胞凋亡机制提供了参考依据。