溶组织梭菌的培养与检测方法及其应用！

一、背景

气性坏疽主要由厌氧梭状牙胞杆菌（Clostridium）引起，是地震、重大自然灾害、战争、车祸伤等的严重并发症。气性坏疽潜伏期短，起病急，进展快，病情凶险，病死率高，临床救治十分困难。特别是战争和地震等自然灾害条件下，若不能早期诊断并进行有效治疗，其伤侧肢体致残、毁损率可高达 40%～50%。目前对厌氧菌的鉴定主要是通过分泌物涂片、厌氧培养、分子生物学诊断等方法。

环介导等温扩增法 (loop-mediated isothermalamplification，LAMP)具有简单快速、灵敏度高的特点，能实现样品前处理简单化的目标，适合在现场快速检测的应用。气性坏疽的主要致病菌包括：产气荚膜梭菌（C. perfringens）、破伤风梭菌（C. tetani）、溶组织梭菌(C. histolyticum)等。其中，对产气荚膜梭菌、破伤风梭菌的快速检验方法已有较多报道。溶组织梭菌（C. histolyticum）具有很强的致病性，作用人体后会释放大量外毒素入血，使患者产生高热、惊厥等毒血症症状，是引起气性坏疽的主要病原菌之一，对其的快速检测研究比较少见。

二、应用

溶组织梭菌主要可用于产胶原酶。从溶组织梭菌发酵上清中可以得到胶原酶，梭菌蛋白酶和其他各种非特异蛋白酶。胶原酶是含锌的金属蛋白酶的一种内肽酶，在一定的 pH 和温度等条件下特异水解胶原蛋白。而哺乳动物所含有的蛋白质中 1/3 是胶原蛋白，构成了细胞附着的网架，因此，胶原酶被广泛应用于组织培养时细胞的分离、培养和移植；手术后创口感染、皮肤慢性溃疡、褥疮、灼伤等疾病的清疮、脱痂；以及注射治疗腰椎间盘突出、眼角膜溃疡和前列腺肥大等疾病，具有极高的应用价值。

从溶组织梭菌培养上清中已经分离到七种（共两类）作用于天然胶原的金属内切蛋白酶，即 I 型胶原酶和 II 型胶原酶。这两型胶原酶免疫学上具有交叉反应，分子序列完全不同。型和型胶原酶分子量变化范围是 68k D～130k D；等电点的变化范围 5.35～6.20。型胶原酶包括胶原酶 α(68k D)、β(115k D)、γ(79k D) 和 η(130k D)。胶原酶粗提物 是一种混合物。对于组织消化，胶原酶粗提物是最有效的，因为除了胶原酶外还有其他不同的蛋白酶共同作用。用高效色谱分离技术纯化的胶原酶和其他的蛋白酶如胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶混合来消化组织也可以达到好的效果。

大部分商品胶原酶或者是直接从溶组织梭菌来源的，或者是在大肠杆菌(Escherichia  coli)中表达的一种重组溶组织梭菌胶原酶。对细菌胶原酶研究最多的是溶组织梭菌的 col H、col G 基因和产气荚膜梭菌的 col A 基因编码的胶原酶，它们均属 Zn 金属蛋白酶，每分子胶原酶含有一个 Zn2+。其中，编码 116k D 胶原酶的col H 基因已经在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中进行了克隆和表达，它由片段结构 S1、S2a、S2b、S3 组成，其中，S2a、S2b 具有同源性。col G 基因也已被序列分析，col G由片段 S1、S2、S3a、S3b 组成；Col A 由 S1、S2a、S2b、S3 组成。

三、培养

溶组织梭菌是一种厌氧菌，具有鞭毛等运动系统，它是引起肌肉坏疽的致病菌。1953 年究了 162 个菌株降解胶原的能力，发现其中只有某些厌氧梭菌如：产气荚膜梭菌和溶组织梭菌具有肯定的胶原水解能力。但产气荚膜梭菌胶原酶的产量明显比溶组织梭菌低，它的培养基滤过液稀释倍数少于 16 倍时才能明显降解胶原，而溶组织梭菌最大稀释倍数能达到 256 倍甚至更高。

正是由于溶组织梭菌分泌的胶原酶具产量高而毒性低的特点，它成为制备胶原酶的首选菌种。有研究描述了一种溶组织梭菌的培养条件，他们研究的液体培养基成分主要由蛋白胨、无机盐、维生素复合物组成，培养条件为 37，p H7.2。同时还研究了溶组织梭菌产生的酶类，发现所有溶组织梭菌株都能产生胶原酶和至少一种其他的蛋白水解酶类。

还有实验研究了产胶原酶菌的培养条件，成功地在仅含有蛋白胨、酶解酪蛋白、大豆蛋白和维生素的培养基中培养溶组织梭菌，这种培养基有利于生物合成胶原酶的最佳条件为 pH 8.5、温度 30。此外成功地用另一种培养基培养溶组织梭菌，在培养基加入其他水解蛋白代替蛋白胨。溶组织梭菌作为一种厌氧菌，在液体培养基中要保证厌氧的环境。

用还原剂巯基乙酸钠和亚硫酸钠保证菌体所需的厌氧环境，获得最高胶原酶产量时还原剂的比例是 1：1。还可以通过突变溶组织梭菌，改善菌种性状，使毒性降低或者使其抑制其他菌类的生长，得到优良菌种。有研究利用化学试剂突变溶组织梭菌，突变菌种和母菌相比，失去了运动系统鞭毛，还失去了合成梭菌蛋白酶(clostripain)的能力。

总之，培养溶组织梭菌是在深层厌氧培养条件下，培养基成分包括碳源、氮源、盐和维生素，温度 32～37，发酵时间 10h～24h。

四、检测

利用环介导恒温扩增法快速检测溶组织梭菌有研究利用环介导恒温扩增技术(LAMP），设计快速检测溶组织梭菌的方法，研究其反应特性，以期能应用于气性坏疽溶组织梭菌感染的临床现场检验。通过基因比对与引物设计，设计针对溶组织梭菌的环介导恒温扩增检测方法。然后检测该方法对溶组织梭菌及其他干扰菌的扩增情况，对其特异性进行评价。

检测该方法对不同浓度溶组织梭菌的扩增情况，对其灵敏度进行评价。最后与全自动细菌培养法进行比较，评价其与常规检测方法的可比性。结果显示LAMP 检测方法只针对溶组织梭菌有扩增，对其他 15 种菌不扩增，显示出良好的特异性。对溶组织梭菌的最低检测限为 1×101CFU/ml，显示其灵敏度较高。

与全自动细菌培养法相比，有良好的可比性，很高的灵敏度（92.6 %）、特异性（98.1 %）及准确度(97.3 %)。该 LAMP 检测方法具有良好的特异性较高的灵敏度，能够用于溶组织梭菌的临床。