B-CPAP人甲状腺癌细胞的培养步骤与应用！

 

一、背景

 

B-CPAP人甲状腺癌细胞是1992年从一个76岁女性的乳头状甲状腺肿瘤转移癌组织中分离得到的纺锤状或圆形细胞贴壁生长的人甲状腺乳头状癌细胞，支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。

 

二、细胞培养步骤

 

1、培养基及培养冻存条件准备：

 

1）准备1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

 

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

 

3）冻存细胞：冻存细胞时，用FBS重悬细胞，然后加入一定量的DMSO，轻轻混合均匀后移入到冻存管中，DMSO终浓度为10%。

 

2、细胞处理：

 

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，离心管加入4mL培养基混合均匀。在800-1000RPM条件下离心4-5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入T25培养瓶中培养，补加培养基至6ml。

 

2）细胞传代：如果细胞密度达80%，即可进行传代培养。

 

传代方法：

 

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

 

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml此细胞的培养基终止消化。

 

3.轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。

 

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:4的比例进行。

 

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

 

三、应用

 

用于CXCR4受体反应系统调控甲状腺乳头状癌细胞迁移、侵袭作用的机制研究：

 

研究SDF-1/CXCR4系统调节甲状腺乳头状癌细胞迁移、侵袭的作用及相关分子机制。

 

材料和方法:

 

1、材料82例人甲状腺乳头状癌组织手术切除标本;B-CPAP购于上海中乔新舟生物科技公司。

 

2、方法：（1）免疫组化检测人甲状腺乳头状癌组织标本中CXCR4的表达。

 

（2）体外培养人甲状腺乳头状癌细胞株（B-CPAP）。设计并合成CXCR4基因CDS区,构建CXCR4过表达的质粒。B-CPAP细胞转染CXCR4过表达质粒或对应的vector（空载质粒）,瞬转获得B-CPAP-vector和B-CPAP-CXCR4细胞。转染48小时后,免疫印迹和荧光定量实验检测各组细胞中CXCR4的表达水平。

 

（3）在B-CPAP细胞中转染CXCR4过表达质粒24小时后,用100ng/ml的SDF-1处理48小时。然后通过划痕实验检测各组细胞迁移能力;通过Transwel l实验检测各组细胞侵袭能力。

 

（4）在B-CPAP细胞中转染CXCR4过表达质粒24小时后,用100ng/ml的SDF-1处理48小时。然后免疫印迹检测E-cadherin（上皮-钙黏素）,N-cadhe rin（神经-钙黏素）,Vimentin（波形蛋白）,NF-κB,磷酸化的IκB（P-IκB）以及细胞核内NF-κB的表达水平。免疫荧光实验检测E-cadherin的表达情况。

 

（5）在B-CPAP细胞中转染CXCR4过表达质粒24小时后,用5μmol NF-κB抑制剂BAY11-7028（BAY）预处理1小时,然后加入100ng/ml的SDF-1处理48小时。免疫印迹实验检测NF-κB、P-IκB以及细胞核内NF-κB的水平;划痕实验检测各组细胞迁移能力;Transwell实验检测各组细胞侵袭能力。

 

3、结果:（1）免疫组化检测结果显示CXCR4在甲状腺乳头状癌组织中高表达；

 

（2）免疫印迹和荧光定量检测结果显示转染CXCR4过表达质粒后,B-CPA P-CXCR4细胞中CXCR4表达明显增加；

 

（3）在B-CPAP细胞中转染CXCR4过表达质粒后,用SDF-1处理,细胞的迁移性和侵袭性显著增强；

 

（4）SDF-1/CXCR4明显减少了E-cadherin蛋白表达量,增加了N-cadhe rin蛋白、Vimentin蛋白的表达量。免疫荧光检测E-cadherin蛋白发现,SDF-1/CXCR4系统可以明显抑制E-cadherin的表达量。表明SDF-1/CXCR4系统促进B-CPAP的EMT过程；

 

（5）SDF-1/CXCR4系统可以显著性提高细胞核中NF-κB的表达量,降低细胞质中NF-κB的表达量,降低细胞中P-IκB的表达量,激活NF-κB信号通路；

 

（6）免疫印迹实验表明NF-κB抑制剂BAY可以提高E-cadherin表达量,降低N-cadherin、Vimentin表达量,抑制了SDF-1/CXCR4系统对B-CPAP的EM T过程的促进作用;划痕实验表明NF-κB抑制剂BAY可以减弱SDF-1/CXCR4系统对B-CPAP迁移能力的促进作用;Transwell实验表明NF-κB抑制剂BAY可以减弱SDF-1/CXCR4系统对B-CPAP侵袭能力的促进作用。

 

4、结论:（1）CXCR4受体反应系统可加强NF-κB通路的信号传导,促进甲状腺乳头状癌细胞的EMT过程,加强乳头状癌细胞的迁移侵袭。

 

（2）NF-κB通路的抑制剂BAY可削弱CXCR4受体反应系统对甲状腺乳头状癌细胞EMT过程的促进作用,减轻CXCR4受体反应系统对甲状腺乳头状癌细胞的促迁移侵袭作用。NF-κB通路可望成为抑制甲状腺乳头状癌细胞迁移侵袭的潜在治疗靶点。