HGC-27细胞的应用与培养操作！

一、背景

HGC-27细胞源自未分化胃癌组织，能分泌粘液素。 HGC-27细胞属于上皮细胞样贴壁细胞，生长培养基：RPMI-1640＋20S＋1%P/S，培养条件气相：空气，95%；CO2，5%；温度：37。

二、培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

三、应用

用于20（S）-原人参二醇型皂苷诱导HGC-27细胞死亡的自噬相关机制研究：

以HGC-27细胞为实验对象,开展完成以下实验:（1）磺酰罗丹明B（SRB）法检测肿瘤细胞存活率;（2）Giemsa染色法观察细胞形态变化及胞质空泡的形成;（3）TUNEL染色法检测细胞凋亡;（4）Western Blot检测凋亡相关蛋白caspase3、自噬相关蛋白LC3与p62;（5）激光共聚焦显微镜免疫荧光共定位检测溶酶体膜完整性与pH变化;（6）高相液相色谱法（HPLC）检测胞内ATP、ADP、AMP含量并分析细胞能荷状态;（7）MitosoxTM Red荧光探针染色,流式细胞术检测线粒体活性氧;（8）JC-1探针染色,荧光显微镜检测线粒体膜电位;（9）透射电子显微镜（TEM）观察细胞器及自噬小体等亚结构。

结果：通过以上实验检测和分析,得到如下结果:（1）20（S）-原人参二醇型皂苷Rg3、Rh2及PPD均有抑制人胃癌HGC-27细胞增殖的作用,其中Rh2细胞毒作用最强（IC50=4.93±0.19μM）,PPD次之（IC50=6.25±0.64μM）,Rg3最弱（IC50=33.31±6.91μM）;当处理浓度为9μM时,Rh2与PPD处理HGC-27细胞6h,可诱导细胞出现明显胞质空泡化现象,与对照组相比,空泡率差异具有统计学意义（p<0.01）,而Rg3组未发现类似现象;

（2）TUNEL染色检测表明三种原人参二醇型皂苷均未诱导典型的细胞凋亡,同时未出现明显cleaved caspase-3的表达,广谱caspase抑制剂z-VAD-fmk对三种人参皂苷所致的细胞死亡无明显改善作用,凋亡并非主要的细胞死亡方式;

（3）Rh2与PPD均可诱导HGC-27细胞内LC蛋白上调,与对照组相比,差异具有统计学意义（p<0.01）,而且在Rh2处理组中,p62蛋白显著积累（p<0.05）;而Rg3处理组LC与p62蛋白均无明显变化。