改良克氏双糖铁培养基的背景与应用！

一、背景

改良克氏双糖铁培养基生化培养基，用于小肠结肠炎耶尔森氏菌的生化反应筛选。

检验原理：蛋白胨、酵母膏、牛肉粉提供氮源、维生素、矿物质；山梨醇、葡萄糖提供可发酵糖类；硫代硫酸钠可被某些细菌还原成H2S，与铁离子生成黑色硫化铁；酚红是pH指示剂，发酵糖产酸变黄，产碱变红；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂。

小肠结肠炎耶尔森氏菌为革兰氏阴性杆菌或球杆菌，大小为1-3.5×0.5-1.3μm，多单个散在，有时排列成短链或成堆。本菌不形成芽胞，无荚膜，有周鞭毛；但其鞭毛在30以下培养条件形成，温度较高时即丧失，因此表现为30以下有动力，而35以上则无动力。

本菌生长温度为30-37，但在22-29才能使本菌的某些特性出现。4时能保存和繁殖。本菌世代时间长，最短亦需40分钟左右。在SS或麦康凯琼脂上于25经24小时培养，菌落细小，至48小时直径才增大成0.5-3.0mm。菌落圆整、光滑、湿润、扁平或稍隆起，透明或半透明；在麦康凯琼脂上菌落淡黄色，如若微带红色，则菌落中心的红色常稍深。本菌在肉汤中生长呈均匀混浊，一般不形成菌膜。

用法：称取本品65.52g,加热溶解于1000ml蒸馏水中,分装于试管,121高压灭菌15分钟,备用。

二、应用

用于实时荧光环介导等温扩增技术检测食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的研究：

实时荧光LAMP技术可以通过与电脑连接，直接观察反应的进行情况，不需要经过繁琐的凝胶电泳观察结果。

研究选择的靶基因是小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因，利用在线引物设计软件设计并选择了一对特异性引物，利用实时荧光监测仪62保温反应60min对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行检测。

最终确定的实时荧光LAMP反应体系为：反应内引物FIP和BIP各3μmol/L，反应内引物F3和B3各0.5μmol/L，其它反应组分分别为：2.5μLdNTPs，0.5mM MgSO4，2μL10×Bst酶缓冲液，1μLBstDNA大分子聚合酶，1μL模板DNA，甜菜碱1mmol/L，荧光染料0.5μL，纯水补足体积到25μL。

研究以小肠结肠炎耶尔森氏菌和其他非小肠结肠炎耶尔森氏菌作为试验用菌株进行实时荧光LAMP的检测，通过对引物特异性进行验证，发现阳性结果均为小肠结肠炎耶尔森氏菌株，而其他的非小肠结肠炎耶尔森氏菌株结果均显示为阴性，由此说明试验所设计的引物特异性良好。

从人工污染的鸡肉中，采用3种方法进行DNA模板的提取，并对其进行比较，结果表明模板的提取方法对反应的影响并不大，即实时荧光LAMP对模板的制备方法要求并不高。

研究还对反应的灵敏度进行了研究，结果表明，对小肠结肠炎耶尔森氏菌纯培养物的检测灵敏度可以达到61CFU/mL，与PCR的方法比较，其灵敏度高出10倍。对人工污染样品的检出限可以达到46CFU/mL。