ECA-109人食管癌细胞的处理与传代及应用！

一、背景

ECA-109人食管癌细胞是于1973年从人食管中段鳞癌组织通过小组织块原代培养建系而来的；Eca-109细胞可在BALB/c裸鼠移植成瘤(STR检测位点同HELA)。

培养基及培养冻存条件准备：

准备RPMI-1640培养基添加NaHCO3 1.5g/L,D-葡萄糖2.5g/L,丙tong酮酸钠0.11g/L)，90%；优质胎牛血清，10%。

培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

细胞处理：

复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

传代方法：

弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

二、应用

用于α-细辛醚对人食管癌细胞系Eca-109增殖抑制作用及机制研究：

运用现代分子生物学实验技术，探讨α-细辛醚抗食管癌作用靶点及机制，为临床运用中药治疗食管癌提供必要的实验依据，同时也为临床治疗食管癌增添一种高效、低毒、价廉的中药制剂。

方法：

1、用不同剂量的α-细辛醚注射液，依次作用在人食管癌细胞株上，四甲基偶氮唑盐法（MTT法）测定Eca-109细胞的增殖抑制率；通过计算细胞增殖抑制率、绘制增殖抑制曲线等，综合分析α-细辛醚对人食管癌细胞系Eca-109细胞增殖活性的影响。

2、应用普通倒置显微镜和倒置荧光显微镜技术，观察α-细辛醚作用于人食管癌细胞系Eca-109后，细胞生长状况及形态学变化。

3、运用流式细胞术，检测细胞周期及细胞凋亡率，探讨α-细辛醚对人食管癌细胞系Eca-109的增殖抑制的作用及机制。

4、采用蛋白免疫印迹技术及荧光定量PCR技术对细胞内的相关蛋白（Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1和CDK4）的表达水平进行分析，探讨α-细辛醚对人食管癌细胞株Eca-109的作用机制及与基因表达调控的关系。

结果：

1、α-细辛醚作用在人食管癌细胞系Eca-109显示有明显的抑制细胞生长的作用，与阴性对照组的比较，差异有统计学意义（P﹤0.05）；计算表明量效关系明显，回归方程为：Y=0.5376X+4.022，其中，R2=0.993，P=0.000﹤0.05。

2、α-细辛醚处理后，可见细胞典型的凋亡改变，细胞缩小、核膜有的厚薄不均或者呈半月形状，另外可见部分细胞膜结构破坏。

3、α-细辛醚作用24小时后，G0/G1期的细胞数显著升高，跟阴性对照组的比较，差异具有统计学意义（P=0.02﹤0.05）；S期的细胞数明显下降，与阴性对照组的比较，差异亦具有统计学意义（P=0.03﹤0.05）。2)凋亡指数和阴性对照组的相比，与剂量的增加成正比，差异有统计学意义（P﹤0.01）。

     4、蛋白免疫印迹方法和荧光定量PCR法检测α-细辛醚作用后细胞内CyclinD1、CDK4表达量明显减少，Caspase-3、Caspase-9表达量显著增加，差异有统计学意义（P﹤0.05）。