人乳腺管癌细胞的应用及处理与传代方法！

一、背景

人乳腺管癌细胞的来源组织是一个乳头状侵入性导管瘤，7个局部淋巴结中3个已有转移。由此组织建立的BT-549细胞是多态性的，包括上皮细胞样组分和多核巨细胞。

二、细胞处理步骤

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

传代方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

三、应用

用于IL-13对与人乳腺癌细胞共培养的人乳腺成纤维细胞自噬基因Beclin1和LC3表达的影响研究：

通过将人乳腺成纤维细胞与人乳腺癌细胞共培养模拟肿瘤微环境，力图探索IL-13在肿瘤微环境中对人乳腺成纤维细胞的增殖和自噬基因表达的影响。

方法：

1、细胞培养：细胞生长在含10%胎牛血清、105U/L青霉素和105U/L链霉素的DMEM培养液中，放入37、5%CO2、100%相对湿度的培养箱培养。

2、实验分组：实验分为4组，空白组（单独培养人乳腺成纤维细胞株Hs578Bst）；IL-13组（单独培养人乳腺成纤维细胞株Hs578Bst并加入终浓度20ng/mL IL-13）；共培养组又称435组（人乳腺成纤维细胞株Hs578Bst与人乳腺癌细胞株MDA-MB-435共培养）；共刺激组（人乳成纤维细胞株Hs578Bst与人乳腺癌细胞株MDA-MB-435悬挂共培养并加入终浓度20ng/mL IL-13）。

3、台盼蓝染色：台盼蓝染色检测各组Hs578Bst细胞的活性。

4、CCK-8法：将105/mL的Hs578Bst细胞接入6孔板，参照分组分别加入终浓度20ng/mL IL-13，或以4:1的比例将Hs578Bst细胞与MDA-MB-435细胞共培养。培养72h后，CCK-8法测定各组Hs578Bst细胞的增殖。

5、免疫细胞化学法：各组细胞培养72h后，免疫细胞化学方法检测Hs578Bst细胞自噬分子Beclin1及LC3II的蛋白表达，IPP6软件测各组两种自噬相关蛋白的平均光密度。

6、实时定量荧光PCR：各组细胞培养72h后，用实时定量荧光PCR检测Hs578Bst细胞自噬分子Beclin1和LC3II的mRNA的表达。