普通肉汤琼脂培养基的应用与使用方法！

一、背景

普通肉汤琼脂培养基用于细菌总数测定、保存菌种及纯培养，也可用于消毒效果测定。

营养琼脂使用原理：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源;氯化钠能维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂。

营养琼脂配方(每升)：蛋白胨10g；牛肉膏粉3g；氯化钠5g；琼脂15g；最终pH 7.3±0.2。

二、营养琼脂使用方法

1、称取本品33g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121高压灭菌15min，备用。

2、(食品)以无菌操作称取检样25克(或25mL)，放入含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的玻璃三角瓶中(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，充分振摇，即为1：10的均匀稀释液。依次做1：100，1：1000……稀释液。

3、根据对样品污染情况的估计，选择2—3个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿。

4、稀释液移入平皿后应及时将凉至46左右的培养基注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，倒置于36±1温箱中培养48±2h。

5、观察结果。

6、菌落计数方法：

做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏，在计下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。

三、应用

用于肥胖与胃食管反流病的关系及肥胖大鼠食管下段菌群及乳杆菌种的变化的研究：

通过细菌培养、变性梯度凝胶电泳（DGGE）及测序的方法,以期了解高脂饮食诱导的肥胖是否可影响食管下段的菌群组成。

方法：1、高脂饮食诱导的肥胖大鼠模型的建立20只SD大鼠适应性喂养1w后,随机分为两组,每组10只,分别为高脂饮食组和正常饮食对照组,7w末处死大鼠,通过对大鼠的体重的变化、Lee’s指数、血清TG、TCH的检测了解高脂饮食大鼠的成模情况。

2、菌群分析方法：通过选择性培养基分析正常饮食及高脂饮食诱导下两组SD大鼠食管下段粘膜可培养细菌的组成及菌群计数变化。总需氧菌：营养琼脂培养基,金黄色葡萄球菌：高盐甘露醇琼脂培养基,放线菌：放线菌肉汤培养基,肠球菌：TTC琼脂培养基,KF链球菌：KF链球菌琼脂培养基,肠杆菌：EMB琼脂培养基,总厌氧菌：厌氧菌琼脂培养基,强化梭菌：强化梭菌琼脂培养基,产气荚膜梭菌：PY琼脂培养基,乳杆菌：LBS培养基,双歧杆菌：BS琼脂培养基。

3、利用分子生物学方法分析乳杆菌种的变化：提取SD大鼠食管下段粘膜可培养乳杆菌DNA,并通过引物扩增16SrDNA产物,使用变性梯度凝胶电泳（DGGE）分离16SrDNA产物,切下单独条带凝胶扩增纯化产物后测序,所得序列在GenBank数据库中进行Blast比对分析。