植物激素脱落酸(ABA)ELISA试剂盒的应用！

一、背景

植物激素脱落酸(ABA)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法检测样本中植物激素脱落酸(ABA)的表达水平。

实验原理：往预先包被激素脱落酸（ABA）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的激素脱落酸（ABA）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

二、样品收集、处理及保存方法

1、样本不能含叠氮钠（NaN3），因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。

2、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行。

3、植物萃取液或其它相关样本：请1000x g离心20分钟，取上清即可检测。

4、保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

三、操作步骤

1、从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4。

2、设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

3、随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱温育60min。

4、弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

每孔加入底物A、B各50μL，37避光孵育15min。

5、每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

四、应用

用于基于纳米材料的植物激素免疫检测及受体分离分析新方法研究：

植物激素是一类植物体中普遍存在的痕量小分子化合物,包括生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯等,对植物生长发育具有重要作用。因此,对其准确、原位、实时测定,及其受体分析,是植物激素生理作用机制及植物生理学研究的重要课题之一。随着科学技术的发展,一些新的植物激素检测技术逐步建立起来,包括色谱法、色谱-质谱联用技术、免疫学方法、电化学方法、分子印迹技术等等。

1、建立基于磁性微球的酶联免疫分析方法,结合CdSe/ZnS纳米晶体信号放大技术,高灵敏检测脱落酸。实验中用卵清蛋白包覆磁球,再以卵清蛋白为桥梁,将脱落酸固定在磁球表面,制成免疫磁球。这种免疫磁球与脱落酸-磁球直接偶联相比,能有效减小磁球对蛋白的非特异性吸附,降低检测背景。在溶液中,免疫磁球和目标物脱落酸与抗体竞争性结合,经过磁分离后,用酶标二抗测定结合的抗体,以间接定量测定脱落酸。实验中以CdSe/ZnS纳米晶体作抗体载体,达到抗原与抗体一对多的目的,实现了化学发光信号放大。该方法比传统酶联免疫分析方法更简单、快速,灵敏度更高,对脱落酸的检测范围为1pM-10M。另外,只需要对方法作适当调整,便可将本方法应用于其它植物激素检测。

2、基于抗体诱导功能化纳米金团聚的原理,以结合态脱落酸为模型,建立均相免疫比色法检测植物激素。虽然磁免疫分析方法结合信号放大技术,检测灵敏度高,但无法避免繁琐的清洗步骤,于是我们建立了更简便的均相免疫比色法。本方法以肽CALNN作配体稳定纳米金并进行功能化,实现了抗体诱导纳米金团聚；当目标分析物存在时,分析物抑制纳米金的团聚,发生逆向颜色变化,以此对目标物进行定量测定。本方法以肽作配体有效减少了纳米金团聚体的颗粒间距,且研究表明,颗粒间距与颗粒粒径成反比,因此使用大尺寸的纳米金可提高方法灵敏度。在最优条件下,本方法对结合态脱落酸检测的线性范围是5nM-10μM,具有良好的准确性、重现性和灵敏度,且可在均相中一步完成测定,比已有的方法更简便、快捷。

3、建立基于量子点-石墨烯FRET（Fluorescence resonance energy transfer）的均相免疫荧光法检测结合态脱落酸。我们建立了以肽CALNN作配体,通过相转移制备功能化水溶性量子点的方法。研究发现,这种量子点具有良好的稳定性和光学性质,非常适合生物分析应用。在此基础上,以抗体修饰的还原型氧化石墨烯为能量受体,通过抗体与脱落酸之间的特异性相互作用,构建脱落酸功能化量子点与石墨烯之间的FRET模型。在目标物存在的情况下,量子点与石墨烯之间的相互作用受到抑制,量子点的荧光得到恢复,以此定量检测结合态脱落酸。