沉淀型TMB显色试剂盒的应用！

一、背景

沉淀型TMB显色试剂盒在HRP的催化下形成不溶性深蓝色产物，可在NC或PVDF膜上形成沉淀线，可用于Western Blot以及其它通过沉淀反应检测HRP的应用。可检测低至0.15ng蛋白质，效果稳定，无需使用暗室及胶片等耗材。

TMB是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶或其他适当过氧化物酶的催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。蓝色产物通常可以在370nm或620-650nm测定吸光度。蓝色底物可以使用2M N2SO4终止反应。加入硫酸后，溶液呈黄色，此时可以在450nm测定吸光度。

作为辣根过氧化物酶的底物，TMB（四甲基联苯胺）与DAB（二氨基联苯胺）是最为常用的，一般情况下，TMB与HRP作用产生的是蓝色的可溶性的显色产物，而DAB产生的棕色不可溶性沉淀，所以一般情况下TMB主要用于ELisa、而DAB主要用于免疫组化等。TMB作为优质的过氧化物酶的底物具有灵敏度高、毒性小（DAB是强致癌性）的特点，但产生的非沉淀型产物限制了TMB的进一步应用。

沉淀型TMB显色试剂盒可产生蓝紫色沉淀TMB显色剂，其主要原理是：TMB经辣根过氧化物酶作用后产生蓝色产物，蓝色产物经特定的试剂富集在膜或细胞上。

二、应用

用于免疫层析试纸条新型信号放大策略的构建与性能研究：

以兔IgG作为模式分析物,在实验室自制了免疫层析试纸条,进一步探讨该信号放大策略的可行性。实验结果表明,在最优条件下兔IgG的线性动态检测范围为1 pg mL-1100 ng mL-1,最低检测限可低至1 pg mL-1。

基于普鲁士蓝纳米颗粒（Prussian blue nanoparticle,PBNP）的信号产生与放大策略的免疫层析试纸条的构建与性能研究PBNP不仅具有颜色,而且具有类过氧化物酶活性,可以催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB）的氧化显色。基于这些特性,本部分工作用PBNP代替胶体金作为标记探针,构建夹心型免疫层析试纸条。

在目标物浓度较高时,PBNPs在检测线处聚集形成明显的蓝色条带;当目标物浓度较低时,PBNPs聚集量较少不能形成的明显的条带,此时在检测线处滴加沉淀型TMB,PBNPs催化TMB氧化产生蓝紫色沉淀从而加深检测线的颜色,达到信号放大的目的。

用该试纸条去检测兔IgG（PBS溶液）并进行信号放大,在优化条件下,获得了10 pg mL-1的检测限,并有从10 pg mL-1到1?g mL-1的宽检测范围,灵敏度与传统胶体金试纸条相比提升了23个数量级。

进一步将兔IgG溶于人血清中模拟临床样品,同样获得了较好的检测结果,证实了本方案在生物医学诊断领域的应用潜能。

为了验证基于PBNP标记的试纸条检测小分子的可行性,改变了PBNP表面的耦合抗体,并设计了竞争型免疫层析试纸用于检测黄豆提取液中的赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）,最低检测限可低至100 pg mL-1。

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