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PEI转染法实验步骤简单介绍

(2023-04-24 10:43:10)

实验所需器材:

PEI 储存液(100 μM):称取125 mg PEI 粉末溶解于50 ml 1×HBS (pH7.4)中, 0.2 μm 滤膜过滤,储存于4备用。
1×HBS (pH7.4):将8.76 g NaCl 溶解于900 ml 超纯水,加入20 ml 1 M 的HEPES,调pH 值到7.4,定容至1 L,过滤(0.2 μm 滤膜)后储存于4、备用。

细胞分盘:通过胰酶消化收集细胞,用适当的完全培养基以4×105 至8×105细胞/cm2 的密度平铺细胞于60 mm 组织培养皿上(根据实验需要选择培养皿,使细胞贴壁后所占总面积达到培养皿面积的70-90%)。根据细胞贴壁情况于含5% CO2 的37温箱中孵育8-24 h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前换入2 mL 预热的无血清培养基。

制备PEI-DNA 混合物:以60 mm 组织培养皿用420 μL 反应总体积为例。准备两支1.5 mL 离心管,一管将质粒DNA(总量2-8 μg 为佳)加入240 μL HBS中,混匀。另一管中则用HBS 将100 μM 的PEI 储存液稀释成10 μM,充分混合。然后取180 μL 10 μM PEI 溶液加入含有DNA 的HBS 中,充分混匀后室温静置20-30 min。最后将这420 μL 的PEI-DNA 混合液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中,轻轻摇动平皿混匀,置于含5%~7% CO2 的37 温箱孵育。

注:每次用100 μM 的PEI 储存液前都需要先将其充分混匀,保证所取的浓度一致。

培养6-10 h 后更换为37预热的含有血清的培养基,继续培养,16 h 左右可以观测到报告基因的表达。

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