基于网络药理学探讨半夏白术天麻汤治疗糖尿病的分子机制*

据《黄帝内经》记载,糖尿病统称为“消瘅”(现代意义为“消渴”),分类的方法主要有上、中、下“三消”。糖尿病是自身体内的胰岛素相对缺乏或绝对胰岛素分泌不足引起代谢紊乱(高血糖)为主要临床特征疾病,其表现的特点为“三多一少”,即生活中饮食的摄入量、饮水量明显增多,排尿量明显增多及平均体重明显下降[1]。已经有文献报道糖尿病主要与胰岛β细胞功能、胰岛素抵抗、胰岛素分泌减少等相关。目前已经有诸多中药、复方及单体成分在糖尿病中发挥重要作用,如白藜芦醇、栀子苷、桂皮醛、三黄汤等 [2-5]。

半夏白术天麻汤的中药处方目前可广泛应用于预防和治疗原发性糖尿病的早期阶段,在糖尿病的治疗中,有效的治疗方法主要有6个方面:复方、单味药、中药有效成分、中药药理与辨证、经方与验方[6-7]。半夏白术天麻汤最先出自清代著名的中医药理学家程仲龄《医学心悟》,由半夏、伏苓、陈皮、天麻、白术、甘草等中药组成,具有清脾润燥、祛痰祛风的保健和食疗功效。茯苓中以茯苓多糖为主要成分,该成分起到降糖效果[8]。甘草中甘草黄酮可影响血脂血糖[9]。白术参与的附子汤加减可对阳虚型糖尿病有作用[10]。以半夏为君药组成的半夏白术天麻汤可降低血糖指标,调节TNF-α、IL-6水平[11-12]。天麻中天麻素可调节血浆中总胆固醇和甘油三酯浓度,以降低血糖[13]。橘红中类似黄酮的川皮苷可预防糖尿病[14]。中药可通过调节胰岛素的分泌,激活胰岛素的受体数目,从而使体内糖分得到利用,胰岛素与受体间的结合以达到降低血糖的作用[15]。综上所述,半夏白术天麻汤用于糖尿病的治疗已经有研究报道,但是其机制尚不明确。

网络药理学是一门融合多门生物相关信息的学科,是单方-单成分-单靶点跨向复方-多成分-多靶点的工具,可以借助现有的数据库、分析软件,描述中药作用于疾病的机制,解决中药治疗疾病难于阐述的难题[16]。目前,网络药理学已经应用到糖尿病的研究中,并取得了一些成果。有研究显示,中药海篷子、延胡索;中药药对葛根-黄芩、黄连生物碱-石菖蒲挥发油、黄精-芡实;中药复方玉液汤、大柴胡汤等都通过多靶点、多通路对糖尿病有潜在治疗作用[17-22]。

本实验以半夏白术天麻汤中的茯苓、半夏、甘草、橘红、天麻、白术6味药为切入点,通过现代分析软件和数据库将中药成分、成分靶点、疾病、疾病靶点、蛋白相互、GO功能和通路富集分析明确半夏白术天麻汤防治糖尿病的分子机制。

1 数据库与软件

TCMSP(https://hfibh1ce4ea985ea14b0fh6wqoukk9x0ck6pxxfixc.res.gxlib.org.cn/LSP/.tcmspsearch/);DrugBank(https://hfibh5602a1daf0e244ccs6wqoukk9x0ck6pxxfixc.res.gxlib.org.cn/);Swiss Target Prediction(https://hfibhecb45f71000f4d2bh6wqoukk9x0ck6pxxfixc.res.gxlib.org.cn/);DAVID(https://hfibh4c031ac560b4469bs6wqoukk9x0ck6pxxfixc.res.gxlib.org.cn/);STRING(https://hfibh4617b94aa23d480cs6wqoukk9x0ck6pxxfixc.res.gxlib.org.cn/);GeneCards(https://hfibhf3a7cb3df79d462ds6wqoukk9x0ck6pxxfixc.res.gxlib.org.cn/);FUNRICH软件(https://hfibhd5755ef8376a4ad5h6wqoukk9x0ck6pxxfixc.res.gxlib.org.cn/);Chem3D 18.0软件;Cytoscape 3.5.1软件(https://hfibh601836dde01c4713h6wqoukk9x0ck6pxxfixc.res.gxlib.org.cn);软件运行于Windows操作系统平台下。处理器为Inter(R)Core(TM)i7-6498DU CPU@2.50GHz,64位操作系统。使用的相关软件已授权或开源软件。

2 方法

2.1 半夏白术天麻汤小分子配体库的构建及活性成分筛选

利用TCMSP数据库分别对半夏白术天麻汤中的白术、天麻、茯苓、橘红、半夏、甘草6味药材进行化学成分检索,并以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18作为活性成分的筛选条件,另外借助专业化学数据库检索天麻的化学成分,对于符合筛选条件的化合物下载其mol 2格式分子结构式。

2.2 半夏白术天麻汤活性成分靶点筛选

将2.1节中mol 2格式化学成分依次导入Chem 3D 18.0软件,进行结构识别,得到个化学成分SMILES格式;在线打开Swiss Target Prediction,以SMILES格式预测各化学成分靶点蛋白名称及Uniport ID等信息,即得半夏白术天麻汤的活性成分的靶点。

2.3 糖尿病靶点筛选

通过GeneCards、DrugBank对DM的靶点进行筛选,以DM全称“Diabetes Mellitus”为关键词进行检索,筛选收集得到糖尿病的相关靶点。利用UniProt数据库的UniProtKB功能将收集到的靶点校正为官方名称(Official GeneSymbol)。

2.4 半夏白术天麻汤-糖尿病靶点富集

利用FUNRICH,将半夏白术天麻汤活性成分靶点蛋白与已筛选的糖尿病所有Gene Symbol(Relevance score≥0.19)进行靶点蛋白富集,筛选出半夏白术天麻汤防治糖尿病的靶点。

2.5 靶点功能及通路注释分析

登陆DAVID平台,对2.4节中获取的富集靶点进行基因本体(Gene Ontology, GO)富集分析及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Ency-clopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析。

2.6 富集靶点蛋白相互作用及网络构建

基于已富集的26个共同靶点蛋白信息,导入String在线平台, 以“人”为种属构建蛋白相互作用,保存为string_interations.tsv格式文件。导入Cytoscape3.5.1软件,制作靶点蛋白网络结构。然后以degree(自由度)值为参考,判断该网络节点对该网路的重要程度。

3 结果

3.1 化学成分收集

基于TCMSP收集半夏白术天麻汤中6味药化学成分共526个,其中,茯苓34个,半夏116个,白术55个,甘草280个,橘红29个,通过专业数据库获取天麻化学成分12个。

3.2 化学成分靶点筛选

基于Swiss Target Prediction对mol2格式各成分进行靶点收集与筛选,茯苓34个成分510个靶点,半夏116个成分1739个靶点,白术55个成分822个靶点,甘草280个成分4192个靶点,橘红29个成分435个靶点,天麻12个成分180个靶点,删除重复项,保留一个重复值。茯苓剩180个靶点,半夏剩585个靶点,白术剩297靶点,甘草剩499个靶点,橘红剩206个靶点,天麻剩111个靶点。

3.3 糖尿病靶点筛选

利用GeneCards数据库筛选糖尿病相关靶点,以“DM”为关键词检索得糖尿病10912个靶点蛋白,删除重复项后剩余10092个靶点。

3.4 靶点蛋白富集

基于FUNRICH,分别导入各味药与疾病靶点蛋白名称数据集,取交得半夏-白术-橘红99个共同靶点蛋白信息(图1),茯苓-甘草-天麻52个(图2),白术-半夏-橘红与茯苓-甘草-天麻两组取交得36个(图3)。糖尿病所有靶点与白术-半夏-橘红、茯苓-甘草-天麻取交得CA1、CA2、CA4、CA3、CA7、AR、ESR1、ESR2、TDP1、MAPT、HMGCR、SLC6A2、ALOX5、ALOX15B、SLC6A4、PTGS1、PTGS2、CA9、ALOX15、ALOX12、PTAFR、AKR1B10、AKR1B1、ADORA1、ADORA2A、STAT3 26个相同靶点蛋白(图4)。26个共同靶点信息见表1。

3.5 GO(基因本体论)富集分析

半夏白术天麻汤与糖尿病的相同靶点蛋白26个,基于DAVID 6.8进行GO分析。令p≤0.01筛选出33个GO条目,其中GOTERM BP(Biological Process 生物学过程) DIRECT 14个,与有机物质反应,细胞坏死、凋亡等调控相关,生物及代谢过程等调控,GOTER CC(cellular component细胞组成) DIRECT 3个,与突触、质膜等方面相关,GOTER MF(Molecular Fubction 分子功能) DIRECT 16个,与药物,神经递质结合和药物结合等相关[17-18]。

3.6 Pathway(通路)富集分析

基于DAVID对半夏白术天麻汤和糖尿病相同靶点蛋白进行通路富集分析,得半夏白术天麻汤参与糖尿病治疗潜在路径,令P≤0.01筛选出 10条参与路径(表2)。结果显示半夏白术天麻汤可能通过以下10条通路治疗糖尿病,分别是Nitrogen metabolism(氮代谢信号通路)、Arachidonic acid metabolism(花生四烯酸代谢信号通路)、Serotonergic synapse(5-羟色胺能突触信号通路)、Regulation of lipolysis in adipocytes(脂肪细胞脂解的调节信号通路)、Prolactin signaling pathway(催乳素信号通路)、Proximal tubule bicarbonate reclamation(近端小管碳酸氢盐回收信号通路)、Folate biosynthesis(叶酸合成信号通路)、Galactose metabolis(半乳糖代谢信号通路)、Fructose and mannose metabolism(果糖和甘露糖代谢信号通路)和Pentose and glucuronate interconversions(戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化信号通路)。再利用R软件对富集的通路绘制更明确的气泡图,纵轴代表通路名称,横轴代表富集程度,气泡图圈的大小程度代表此通路中差异基因数量成正相关,即圈越大,富集差异基因数量越多,气泡颜色深浅和P(Pvalue)值呈负相关,即气泡颜色越浅富集越显著[19]。如图5所示。

3.7 蛋白质相互作用分析和网络构建

利用STRING对糖尿病与半夏白术天麻汤中6味药相交26个靶点蛋白,进行相互作用分析,通过Cytoscape3.5.1软件得到呈现不同程度大小、连接不同的边数的网络图。节点表示蛋白质,连接边数量表示各蛋白质间的作用关系强度。如图6示: PTGS2(前列腺素内过氧化物合酶2) degree=12,为相互作用网络图中节点最大,半夏白术天麻汤治疗糖尿病预测最关键的靶点蛋白,STAT3(信号传导与活化转录因子3)、ESR1(雌激素受体1) degeree=6,作用次之,ADORA1(腺苷A1受体)和ADORA2A(腺苷Aa 受体)两靶点未参与蛋白相互作用[20]。

4 结论

4.1 通路分析

半夏白术天麻汤(半夏、白术、天麻、茯苓、橘红、甘草)通过参与多条通路达到治疗糖尿病的作用。涉及糖代谢的通路有3条,分别是Galactose metabolis(半乳糖代谢信号通路)、Fructose and mannose metabolism(果糖和甘露糖代谢信号通路)和Pentose and glucuronate interconversions(戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化信号通路)。

4.2 关键靶点

半夏白术天麻汤(半夏、白术、天麻、橘红、茯苓、甘草)作用于糖尿病的靶点根据degree(degree≥5)值筛选有8个关键靶点:分别为PTGS2(前列腺素内过氧化合酶2)、STAT3(信号传导与活化转录因子 3)、ALOX5(花生四烯5-脂氧合酶基因)、PTGS1(前列腺素内过氧化合酶1)、ALOX15(花生四烯酸15 -脂氧合酶)、ALOX12(花生四烯酸12 -脂氧合酶)、ALOX15B(花生四烯酸15-脂氧合酶2抗体)、ESR1(雌激素受体1),其中PTGS2(degree=12)为最核心靶标。

5 讨论

糖尿病是一种多通路导致的代谢性疾病,其形成机制复杂多变,目前以西药治疗为主,长时间服用所导致的副作用较大,且依赖性较强。中药及中药复方多靶点,多途径治疗糖尿病,副作用小的优势逐渐被人们关注[21]。由此可见为避免单条通路治疗疾病的局限性,开发多条通路治疗糖尿病的药物具有重要意义。此研究通过药物成分、疾病靶点、GO分类、通路分析、蛋白相互作用分析等预测半夏白术天麻汤(白术、半夏、茯苓、橘红、甘草、天麻)多通路、多靶点治疗糖尿病的分子机制。已有研究证明基于糖代谢相关通路治疗糖尿病的有:IKK/NF-κB、PI3K/Akt、AMPK这三条信号通路可对葡萄糖代谢全过程进行调节[22]。此研究说明半夏白术天麻汤参与的Galactose metabolis(半乳糖代谢信号通路)、Fructose and mannose metabolism(果糖和甘露糖代谢信号通路)和Pentose and glucuronate interconversions(戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化信号通路)均可对糖代谢产生影响,为研究半夏白术天麻汤多信号通路治疗糖尿病提供参考依据。

本研究通过网络药理学明确半夏白术天麻汤(白术、半夏、茯苓、橘红、甘草、天麻)可能通过PTGS2、STAT3、ALOX5、PTGS1、ALOX15、ALOX12、ALOX15B、ESR和PTGS2等核心靶点治疗糖尿病。其中PTGS(COX)为最核心靶点,PTGS为前列腺素合成酶,是分解花生四烯酸产生前列素的限速酶。已有研究证实:糖尿病常伴有炎症反应,PTGS家族成员为糖尿病治疗过程中的关键靶点[23]。STAT3通常参与调节癌细胞生命过程,目前被视为治疗癌症的关键靶点。ESR1为治疗GH腺瘤的靶点,其相关拮抗剂能降低GH3细胞的细胞增殖和侵袭能力。本研究初步为半夏白术天麻汤治疗糖尿病的实验研究提供理论依据,下一步将采用体内实验进行验证分析。

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