ripa裂解液[ 1L]配方：
30ml 5mol/L NaCl  100ml 10%NP-40   

2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接

摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10　，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1，000，000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg，也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380bp，则0.03pmol为

0.03×5.38×0.66=0.106524µg。

测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。

连接反应： TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单 位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性

①促进细胞因子合成
促进细胞因子合成与释放是TLR-NF-B最突出的生物学功能。单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等通过膜表面的TLR感受入侵病原体的PAMPs刺 激后, 经胞内信号转导通路, 活化胞核内NF-B, 启动核内相关基因, 合成 IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、 TNF-及IFN-等细胞因子并释放到胞外, 趋化粒细胞、巨噬细胞, 增加毛细血管通透性, 引起淋巴细胞浸润等反应, 发挥早期免疫应答的效应（怎么测？）。TLR 家族同时也参与炎症反应或炎症病理反应， 因此抑制TLR作用的药物可能成为抗炎药, 也可能成为治疗自体免疫疾病的药物, 不断加深对TLR信号系统的理解也是治疗各种疾病的基础。

②调节免疫反应
TLR感受入

对于RNA跑成一条带可能有几种可能:
1.点样量太多,两条带分不清,建议多跑一会,上样量太多不仅会造成两条带分不清,而且会造成你的28S/18S亮度比非2:1，会变小。
2.有可能提取有问题,这条带为DNA ,而非RNA ，最好做RNA Marker对照
3.可以用RNase（或DNase）酶消化来鉴定这条带是不是RNA
4.可以大概估计一下，因为28S和18S大概在4.5kb和1.9kb的位置，DNA的分子量很大，你可以通过这条带距离点样孔的位置粗略的估计一下

因为28S和18S大概在4.5kb和1.9kb的位置
==================================================================你这个电泳RNA完全降解了，全部降解成5S大小的片段，不是5S非常亮，是严重降解的片段往往是和5S大小近似，所以，跑电泳的时候，就会在5S位置重叠。所以，你会觉得5S很亮。
至于这个降解是提取失败降解了，还是电泳过程中降解的，都有可能。
你可以做个阳性对照，比如RNAiso实际就是trizol，你可以提取一个细胞，或者组织肯定可以提取成功的样品做阳性对照。如果这个组织细胞的样品都没有提取出来，那就是2种情况：1产品质量有问题。2，电泳系统有问题，电泳过程中降解了。
==

【详细说明】

产品名称                  规   格                                  包装            货号
细胞培养皿 直径35mm，用途:细胞培养，生长面积8cm2                  40只/2包    原厂货号：430165
细胞培养皿 直径35mm，用途:细胞培养，生长面积8cm2                  500只/箱    原厂货号：430165
细胞培养皿 直径60mm，用途:细胞培养，生长面积21cm2                 500只/

各位前辈：我想把microRNA转到成纤维细胞内，用的是GIBCO(tm) Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X)和Lipofectamine™ 2000转的。现在的问题是一加转染试剂细胞就大量死亡。Opti-MEM和冲洗用的PBS都37度预热过的。甚至我用无血清的DMEM对照也大量死亡。 有时细胞死亡稍微好点，是不是和细胞批次关系更密切，还是有其他原因。

我的实验操作 ：
1 10%血清DMEM接种细胞在24孔板，长至30~50%满底时进行转染。
2 lipofectamine2000 0.5ul稀释于25 ul Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (1X) （GIBCO）静置5分钟
3 microRNA 10pM 稀释于25 ul Opti-MEM
4 混匀2和3，加Opti-MEM至500ul。室温静置30min。
5 用PBS(室温)轻轻冲洗培养空，镜下观察部分细胞略变圆（或有变圆倾向），但没什么细胞浮起。吸去PBS，轻轻加入2和3的混合物。镜下观察，即刻细胞 大量浮起，或细胞挛缩，有细胞死亡倾向。6h后证实细胞大量死亡。但有细胞干死在培养皿底的印迹。不同批次的细胞，死亡情况略有不同。
请大家一起帮我寻找原因，谢谢了。

-----------------------------------------------------------------------------------

His-Tag 表达蛋白纯化原理、方法和问题分析

如果你要表达的是完整的基因，而且你的表达方法是非融合表达的话，设计引物时就需要把起始密码子和终止密码子分别设计在上游和下游引物中，但是，如果你所用的表达方法是融合表达的话就可能仅需要设计始密码子或终止密码子。要多看些文献并看看你所用的表达载体的特性。