第十四章　核酸的物理化学性质

一、核酸的水解

二、核酸的酸碱性质

三、核酸的紫外吸收

四、核酸的变性、复性及杂交

 

第十五章　核酸的研究方法

一、核酸的分离、纯化和定量测定

二、核酸的超速离心

三、核酸的凝胶电泳

四、核酸的核苷酸序列测定

五、DNA聚合酶链反应（PCR）

 

第十四章　核酸的物理化学性质

核酸的化学结构和作为高聚物决定其理化性质：

核酸的糖苷键和磷酸二酯键：可被水解；

磷酸基和碱基：酸碱性质；

碱基：紫外吸收特性；

双螺旋结构：变性和复性。

 

一、核酸的水解

（一）酸水解

糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解，产生嘌呤和嘧啶碱

（二）碱水解

RNA的磷酸酯键更易被碱水解（RNA的核糖上有2’-OH，在碱作用下形成磷酸三酯，极不稳定易水解，产生核苷2’，3’-环磷酸酯，继续水解产生2’-核苷酸和3’-核苷酸）

（三）酶水解

专一水解核酸的磷酸二酯键的酶称为核酸酶(nuclease)。

能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶）。

 

1、核酸酶的分类

（1）按底物专一性分类：

     核糖核酸酶（ribonuclease,RNase）：作用于核糖核酸；

     脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease,DNase）：作用于脱氧核糖核酸；

（2）按底物作用的方式分类：

     核酸外切酶（endonuclease）：从多核苷酸链的末端开始,逐个将核苷酸切下的酶；

     核酸内切酶(exonuclease)：从多核苷酸链的内部开始水解核酸的酶。

（3）按磷酸二酯键断裂的方式分类：

一种是在3’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是5’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（1）；

另一种是在5’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是3’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（2）。

2、核糖核酸酶类

牛胰核糖核酸酶、核糖核酸酶T1、核糖核酸酶T2等；

 

3、脱氧核糖核酸酶类

牛胰脱氧核糖核酸酶、牛脾脱氧核糖核酸酶、限制性内切酶等。

4、N－糖苷酶

 

二、核酸的酸碱性质

1、碱基的解离

 

2、核苷的解离

3、核苷酸的解离

核苷酸有磷酸与碱基，为两性电介质；

U的碱基碱性极弱，不能形成兼性离子；

A,G,C中，

    pK1’：第一磷酸基-PO₃H₂的解离；

    pK2’：含氮环＝N⁺H^-的解离；

    pK3’：第二磷酸基-PO₃H^-的解离；

    故其pI＝（ pK1’ + pK2’ ）／2

DNA变性双链打开后，碱基即参与酸碱滴定。

 

三、核酸的紫外吸收

Py和Pu有共轭双键，使 碱基、核苷、核苷酸和核酸能吸收紫外光，在260nm紫外光区有最大光吸收；

A260可用于核酸的定量分析；

A260/A280的比值可用于判断样品的纯度;

核酸的摩尔磷吸光系数可用于判断DNA制剂是否变性或降解。

 

纯核酸样品的定量：测A260

A260＝1　相当于：

50ug/ul 双链DNA

40 ug/ul 单链DNA或RNA 　　

20ug/ul 寡核苷酸　　　　　

 

紫外分光光度法鉴定核酸的纯度

A260/A280比值

>1.8　　　纯DNA

达到2.0　  纯RNA

<1.8　　　有杂蛋白　

 

核酸变性时，ε（P）升高：增色效应

核酸复性后，ε（P）降低：减色效应

 

四、核酸的变性、复性及杂交

在理化因素作用下，DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致DNA的理化性质及生物学性质发生改变，这种现象称为DNA的变性(denaturation) 。

变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。

 

       引起DNA变性的因素主要有：

　①高温，②强酸、强碱，③有机溶剂等。

     DNA变性后的性质改变：

　①增色效应：指DNA变性后对260nm紫外光的光吸收度增加的现象；

　②旋光性下降；

　③粘度降低；

　④生物学功能丧失或改变。

 

DNA的变性温度（Tm值）：加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的变性温度（也叫熔点或熔解温度，一般在82-95℃之间）。

 

DNA的Tm值大小与下列因素有关：

    （1）DNA的均一性：均质DNA的Tm范围较小，异质DNA的Tm范围较大（ Tm可作为衡量DNA均一性的标准）

    （2）G-C的含量：G+C的含量越高，则Tm越高。Tm＝69.3+0.41(％ G＋C)（可由GC含量计算Tm）；

    （3）介质中的离子强度：离子强度高，Tm较高，且Tm范围较小（高盐buf中保存DNA）

 

（二）复性

　将热变性后的DNA溶液缓慢冷却，在低于变性温度约25～30℃的条件下保温一段时间，则变性的两条单链DNA可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的性质。

变性DNA在适当条件下，又可以使两条彼此分开的链重新缔合（reassociation）成为双螺旋结构，这过程称为DNA的复性(renaturation)；

变性DNA在缓慢冷却时，可以复性，此过程称为退火（annealing)。

 

Cot1/2　（mol·s/L）

      Cot1/2可以衡量复性反应的速度；

      　　　Co：变性DNA复性时的初始浓度，以核苷酸的摩尔浓度表示（mol/L）

      　　　t：时间（s）；

      　　　Cot1/2：表示复性一半的Cot值；

      DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。

 

（三）核酸的杂交

两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂合双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交（hybridization）。

核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA杂交。

 不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序。

在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。这种带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针。 

利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的DNA或RNA片段。

 常用的核酸分子杂交技术有： Southern杂交（DNA转移后再杂交，鉴别DNA）及Northern杂交（ RNA转移后再杂交，鉴别RNA） 、原位杂交、斑点杂交等。

 

第十五章　核酸的研究方法

 

一、核酸的分离、纯化和定量测定

（一）DNA的分离

利用核蛋白（DNP）溶于水和高盐溶液，但不溶于生理盐溶液的性质进行分离；

流程：破细胞——浓盐溶液提取——生理盐溶液沉淀——苯酚变性除蛋白——水相DNA用冷乙醇沉淀

 

（二）RNA的分离

RNA比DNA更不稳定，且RNase无处不在，制备RNA时应注意：

　　（1）0.1%DEPC处理器皿，去除RNase；

   　（2）强变性剂（胍盐）使RNase失活；

　   （3）加入RNase的抑制剂（ RNasin ）。

小量制备RNA：酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提；

大量制备RNA：胍盐/氯化铯将抽提物密度梯度离心（RNA在底部）；

分离poly(A)+mRNA：寡聚胸腺嘧啶核苷酸（oligo(dT)n）亲和层析法。

 

（三）核酸含量的测定法

核酸提取前需要预处理，除去酸溶性含磷化合物及脂溶性含磷化合物；

生物组织中核酸组分的分离方法：热酸法；冷酸法；碱法（p514）。

核酸含量测定方法：

　（1）紫外分光光度法；

　（2）定磷法：钼蓝比色法

　（3）定糖法：

　    　 RNA+盐酸——糠醛+地衣酚——Ａ670，鲜绿色；

　     　DNA+二苯胺——Ａ595,蓝色化合物

 

二、核酸的超速离心

可用于测定核酸的沉降常数和相对分子量；

密度梯度沉降平衡超离心法：

1、测定核酸密度；

2、测定DNA中G-C的含量(正比关系)；

3、溶液中核酸构象的研究；

4、核酸的制备（溴化乙锭－氯化铯密度梯度平衡超离心，分离不同构象的DNA，RNA及蛋白质，是纯化质粒DNA时常用的方法）

 

三、核酸的凝胶电泳

（一）琼脂糖凝胶电泳:

　　　分析DNA；测定DNA片段的分子量（相对分子量标准）；胶上DNA回收；

（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳：

　　　分析相对分子量小于1kb的DNA和RNA，常用垂直板电泳。

 

四、核酸的核苷酸序列测定

(一)DNA的酶法测序：

1、加减法：Sanger，1975年

 

2、终止法： Sanger，1977年

 

（二）DNA的化学测序

（三）RNA的测序（酶特异切断RNA链；化学试剂裂RNA；逆转录成cDNA）

 

五、DNA聚合酶链反应（PCR，polymerase chain reaction）

1985年，K.Mullis发明的体外扩增DNA的技术——应用最广泛的一种生物技术；

基本步骤：

　（1）设计一对引物；

　（2）优化反应体系；

　（3）选择3个温度进行热循环（变性－退火－延伸）；

　（4）凝胶电泳检测结果。

PCR技术广泛应用在检测、刑侦、基因分离克隆等方面。

 

第14章　重点及知识点

重点：核酸水解，变性和复性

知识点：

　1、核酸的水解

　2、核酸的酸碱性质

　3、核酸的变性，复性和杂交

 

第15章　重点及知识点

重点：核酸的研究方法

知识点：

　1、核酸的分离，提纯和定量测定方法；

　2、核酸的核苷酸序列测定；

　3、PCR技术