细胞传代后不贴壁的主要原因及解决方法有哪些？

 

百欧博伟生物：细胞传代后不贴壁是细胞培养中常见的棘手问题，原因多种多样，需要系统排查。以下是一些主要原因及相应的解决方案：

 

主要原因

 

1、消化过度：

 

原因：胰酶/EDTA或其他消化酶作用时间过长、浓度过高、温度过高（如室温较高时操作），导致细胞膜表面负责贴壁的蛋白（如整合素）被过度破坏或消化。

 

表现：细胞在传代后呈圆形、漂浮，或者贴壁后很快又脱落，形态变圆、死亡。

 

解决方案：

 

严格控制消化时间：在显微镜下密切观察细胞形态，当大部分细胞变圆、边缘开始收缩但尚未脱落时，立即终止消化。不同细胞系、不同密度、不同代次的细胞消化时间差异很大，不能一概而论。

 

优化消化酶浓度：尝试降低胰酶浓度或使用含EDTA浓度更低的消化液。

 

快速有效中和：消化后立即加入足量（通常是消化液体积的2-5倍以上）的、含血清的完全培养基中和胰酶。血清中的胰酶抑制剂能迅速灭活残留胰酶。避免仅用PBS或不含血清的缓冲液冲洗后就加培养基。

 

低温操作（可选）：对于特别敏感的细胞，可以在冰上或4°C进行消化（胰酶活性降低），但需要更长时间，且操作要快。

 

2、血清问题：

 

原因：

 

血清质量差/批次问题：不同批次的血清中促贴壁因子（如纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白等）含量差异可能很大。劣质或不适用的血清无法提供足够的贴壁因子。

 

血清浓度不足：新配制的完全培养基中血清浓度过低。

 

血清失效：血清反复冻融次数过多、储存不当（如未在-20°C或更低温度保存）、过期。

 

解决方案：

 

更换血清批次：尝试使用不同批次的优质胎牛血清或适用于该细胞的特种血清。最好使用同一大瓶血清进行对比实验。

 

提高血清浓度：短期内可尝试将血清浓度提高到15%-20%以帮助细胞贴壁，待细胞贴壁稳定后再换回正常浓度（注意：高浓度血清可能改变细胞特性）。长期应确定该细胞系所需的最佳血清浓度。

 

确保血清储存和使用规范：避免反复冻融，分装储存。使用前在4°C缓慢解冻（避免37°C水浴快速解冻）。检查有效期。

 

3、细胞状态不佳/老化：

 

原因：

 

传代前细胞过度融合或老化：细胞长满后没有及时传代，处于接触抑制或衰老状态，活力下降，贴壁能力减弱。

 

传代次数过多：细胞经过多次传代后发生衰老或遗传漂变，失去正常贴壁能力。

 

传代时密度过低：接种密度太低，细胞分泌的促贴壁因子和生长因子不足，无法形成良好的贴壁微环境。

 

冻存/复苏损伤：冻存或复苏过程不当导致大量细胞死亡或活力严重受损。

 

解决方案：

 

在合适密度时传代：细胞融合度达到70%-90%时进行传代，避免100%融合或更久。

 

控制传代次数：使用低代数的细胞进行实验。定期从冻存的原始细胞库中复苏新细胞。

 

提高接种密度：尝试以更高的密度接种细胞（例如，比常规密度高1.5-2倍）。待细胞贴壁生长良好后，再按常规密度传代。

 

优化冻存复苏流程：使用合适的冻存液（含DMSO和足量血清）、程序降温盒或程控降温仪冻存。复苏时快速解冻，及时稀释去除DMSO。

 

4、污染：

 

原因：

 

细菌/真菌污染：污染会改变培养基pH、消耗营养、释放毒素，导致细胞死亡或无法贴壁。

 

支原体污染：非常常见且不易察觉。支原体消耗培养基中的精氨酸等营养物质，改变pH，产生有毒代谢物，严重影响细胞代谢、生长和贴壁。

 

解决方案：

 

严格无菌操作：这是根本。操作规范，勤换手套，使用抗生素（但注意抗生素不能防支原体，且可能掩盖污染）。

 

定期检测污染：特别是支原体，建议定期（如每月）对所有培养细胞进行支原体检测。一旦发现污染，果断丢弃所有相关培养物，彻底清洁培养箱和工作区域，从无污染源的冻存细胞重新开始培养。

 

观察培养基：浑浊、pH迅速变黄（变酸）、镜下可见异物或细菌/真菌菌丝孢子，都是污染的迹象。

 

5、培养基问题：

 

原因：

 

pH值不正确：CO2浓度设置错误（与培养基碳酸氢钠缓冲系统不匹配）、培养箱门开关频繁导致CO2波动、培养基缓冲能力不足（如长期开盖操作）、酚红颜色异常（过酸-黄，过碱-紫红）。

 

渗透压异常：配置错误或储存不当。

 

营养不足或成分错误：使用了错误的培养基配方、储存过期、反复开瓶使用导致成分降解或污染。

 

关键添加剂缺失或失效：如L-谷氨酰胺降解（尤其在4°C储存几周后）、未添加必要的生长因子或特殊添加剂。

 

解决方案：

 

校准培养箱：确保CO2浓度（通常5-7%）、温度（37°C）和湿度稳定准确。减少开门时间。

 

检查培养基颜色：正常应为红色或橙红色（取决于配方）。变黄则过酸，变紫则过碱。必要时用新鲜培养基换液。

 

使用新鲜培养基：避免使用开瓶过久（>1个月）或反复开瓶的培养基。注意L-谷氨酰胺的稳定性，必要时添加新鲜谷氨酰胺。

 

核对培养基配方：确认使用的是该细胞系推荐的基础培养基和所有必需添加剂。

 

检查渗透压（如有条件）：应在280-320 mOsm/kg范围内。

 

6、培养器皿问题：

 

原因：

 

表面处理不当：某些细胞系需要包被（如多聚赖氨酸、胶原蛋白、明胶、纤连蛋白等）才能良好贴壁。培养瓶/皿未进行必要的包被。

 

残留清洗剂/毒素：培养器皿清洗不彻底，残留洗涤剂、消毒剂或灭菌剂。

 

表面性质改变：使用不适用于该细胞系的特殊表面处理培养皿。

 

解决方案：

 

确认是否需要包被：查阅文献或ATCC等细胞库资料，确认该细胞系是否需要特殊包被。如需，严格按照包被程序操作（浓度、时间、冲洗）。

 

使用新的或可靠供应商的培养器皿：避免使用清洗后可能有残留的器皿（除非有严格的清洗验证程序）。新开封的器皿最安全。

 

确保灭菌后乙醇完全挥发：如果用乙醇消毒培养瓶内部，务必在超净台内用无菌风吹干或放置足够时间让乙醇完全挥发后再使用。

 

检查培养器皿类型：确认使用的是标准细胞培养处理的器皿，而非用于悬浮培养或特殊用途的器皿。

 

7、物理损伤：

 

原因：在吹打细胞（吹散细胞团块或终止消化）时用力过猛，产生大量气泡或剪切力过大，导致细胞机械损伤。

 

解决方案：吹打动作要轻柔，使用口径较大的移液管（如5ml或10ml移液管），避免产生过多气泡。让细胞团块自然沉降分散，不要过度吹打。

 

环境因素：

 

原因：传代后细胞在培养箱外放置时间过长（如等待离心），温度、CO2和pH不稳定。

 

解决方案：尽量减少细胞离开培养箱的时间。操作步骤衔接紧凑。如果确实需要短暂放置，确保在室温（对大多数哺乳动物细胞）或冰上（视情况而定）进行。

 

排查与解决步骤建议

 

观察与记录：仔细观察不贴壁细胞的形态（是死亡漂浮的碎片？还是存活但圆形的细胞？）、数量、发生时间（传代后立即漂浮？几小时后才漂浮？）。记录所有操作细节（消化时间、血清批次、培养基配制日期、接种密度等）。

 

优先检查最可能的原因：

 

立即检查：培养箱参数（CO2, 温度）、培养基颜色（pH）、是否有肉眼可见污染。

 

对比实验：这是最有效的方法。

 

血清批次对比：同时用新旧两个批次的血清配制完全培养基，平行接种细胞。

 

消化时间对比：设置不同的消化时间梯度（例如，比常规时间缩短30秒、1分钟、2分钟），观察哪个时间点细胞贴壁恢复最好。

 

接种密度对比：尝试以显著高于常规的密度接种一部分细胞。

 

包被对比：如果怀疑需要包被，将部分培养器皿进行包被后接种。

 

更换关键试剂：使用全新开封的培养基、血清、胰酶、PBS等。

 

检测支原体：如果其他常见原因排查后仍无法解决，务必进行支原体检测。

 

复苏新细胞：如果怀疑是细胞本身状态问题（老化、传代次数过多、潜在污染），从原始冻存库中复苏一管新的低代数细胞进行尝试。

 

总结：细胞不贴壁往往不是单一原因造成的，需要耐心、细致地逐一排查。消化过度、血清问题（质量/批次/浓度）和支原体污染是最常见且重要的原因。进行严格的对照实验是找到问题根源的关键。养成良好的实验记录习惯，对快速定位问题非常有帮助。

 

希望这些建议能帮你顺利解决细胞贴壁问题！培养箱里的那些小家伙确实需要细致照料，但看到它们重新健康贴壁生长时的成就感也是无与伦比的。

 

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