加载中…Western转膜实用技巧，赶紧Get起来！
(2016-09-20 10:39:01)
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Western实验中，经过SDS-PAGE电泳分离后的蛋白质样品需经过“转膜”步骤，从PAGE胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行Western Blot的检测和显示，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转膜要尽快进行。转膜是对Western最终结果影响最大的一步，转膜质量的好坏直接决定了实验结果的好坏。下面介绍一些实用技巧，赶紧Get起来吧。
1.
膜的选择
膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑，例如做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的膜是不可取的，因为可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白含量不确定，从而影响最终结果的可靠性。通常小于20KDa的蛋白选择0.2um的膜，而大于20KDa的蛋白选择0.45um的膜。常见的膜有NC膜和PVDF膜，区别如下：
|
|
NC膜 | PVDF膜 |
| 灵敏度和分辨率 | 高 | 高 |
| 背景 | 低 | 较高 |
| 结合能力 | 80-110ug/cm2 | 125-200ug/cm2 |
| 材料质地 | 干的NC膜易脆 | 机械强度高 |
| 溶剂耐受性 | 无 | 有 |
| 操作程序 | 缓冲液润湿，避免气泡 | 使用前100%甲醇润湿 |
| 检测方式 | 常规染色，可用放射性和非放射性检测 |
常规染色，可用考马斯亮蓝染色， ECL检测，快速免疫检测 |
| 价格 | 较便宜 | 较贵 |
2. 转膜条件
不同分子量的蛋白质选择的凝胶浓度和转膜时间也是不同的，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，转膜时间较长，而低分子量蛋白用高浓度胶分离，采用较短的转膜时间，下表可供参考：
| 分子量(kDa) | 凝胶浓度 | 转膜时间（h) |
| 140-200 | 6% | 2.0-3.0 |
| 80---140 | 8% | 1.5-2.0 |
| 25---80 | 10% | 1.5 |
| 15--40 | 12% | 0.75 |
| <20 | 15% | 0.5 |
3. 转膜操作注意事项
（1） 避免直接接触膜，全程戴手套并使用镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑；
（2） PVDF膜具有疏水性，使用之前需用甲醇浸泡；
（3） 排列三明治时，尽量用干净的玻璃棒或试管赶走胶和膜之间的气泡，避免转膜不均匀；
（4） 确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否则会导致电流不能通过膜，从而转膜无效；
（5） 鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高背景，故如果选择鸡来源的抗体，最好使用**纤维素膜（NC膜）。
4.
转膜后丽春红染色
为检测转膜是否成功，可以用丽春红进行染色，将膜放入TBST洗一次，然后置于丽春红染色工作液中，室温下摇动染色5分钟，大量的水洗膜，直至水变清无色，蛋白条带清晰。
转膜常用产品列表
更多信息，敬请关注联科官网
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