加载中…用PCR产物为模板增加产物量，以减少所需的模板，是否会引起突变？
(2013-05-13 17:25:51)
标签：
pcr实验校园 |
分类： PCR实验问题 |
由于做PCR的模板有限，但又需要一定的产量测序，观察某一基因外显子有无突变，想用PCR产物为模板增加产物量，以减少所需的模板，但听说这样会引起人为的点突变，想知道这样引起的突变可能性有多大，合不合理。
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用PCR产物为模板作2次扩增，这种方法是可行的，但是要注意以下几点！
1.最好第2次扩增时使用的引物与第一次不同，即最好是Nest
PCR，至少应该有一端引物不同，即半巢式引物。这样有助于扩增，并减少突变。
2. 产物作为模板，应该浓度尽可能低一点，因为浓度高也容易引入突变。与基因组DNA相比，第1次扩增的产物来作模板实在太浓了。作一系列不同浓度模板的试验，我的经验是至少要1：100稀释以上才行。
3. Taq酶的问题：尽量应用保真性高的Taq，如Pfu。如果要作T-A克隆的话，可以使用Taq-Plus，既可以产生有A末端的产物，又具有较高的保真性。
2. 产物作为模板，应该浓度尽可能低一点，因为浓度高也容易引入突变。与基因组DNA相比，第1次扩增的产物来作模板实在太浓了。作一系列不同浓度模板的试验，我的经验是至少要1：100稀释以上才行。
3. Taq酶的问题：尽量应用保真性高的Taq，如Pfu。如果要作T-A克隆的话，可以使用Taq-Plus，既可以产生有A末端的产物，又具有较高的保真性。
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