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microRNA RT-PCR实验方法介绍

(2016-06-22 12:54:33)
标签:

rt

pcr

microrna

Stem-loop实时定量RT PCR

传统实时定量RT PCR只能检测到miRNA前体,而Stem-loop实时定量RT PCR技术可以解决这一问题。Stem loop实时定量RT PCR是一项高特异度、敏感度的检测miRNA表达的实验技术,包括设计具有茎环(stem loop)结构的反转录引物和用miRNA荧光标记的特异分子探针进行实时PCR 二个关键步骤。该技术具有以下优点:高度特异性,对序列高度同源的miRNA也可精确区分;超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度;样品消耗少,仅需1~10 ng的总RNA;适用范围广,总RNA、细胞裂解物以及纯化的RNA都可用于miRNA的定量检测。

Stem-loop实时定量RT PCR基本原理: microRNA的RT-PCR一般使用茎环结构的引物,这种具有茎环结构的引物针对所需检测的目的microRNA设计,具有特异的序列,结构示意图如下所示。内参使用的是小RNA U6,U6的反转录使用的是随机引物。将反转录的产物作为real-time PCR的模板,检测目的microRNA的引物是针对目的microRNA的特异的上下游引物,检测内参使用的是针对U6的特异的上下游引物。

实验过程

1、用Trizol抽提total RNA,抽提方法同普通的RNA的Trizol抽提,只是在用异丙醇处理时需要4℃ 过夜。将抽提得到的RNA置于-80℃保存。

2、将抽提的RNA进行反转录。反转录的体系一般使用12.5ul的体系。具体的体系如下:

A: RNase free water

B: Total RNA: 0.625ug

C: Impron buffer: 2.5ul

D: dNTPs: 2.5ul

E: RNase inhibitor: 0.625ul

F: Impron Mgcl2: 1.5ul

G: Primer: 0.5ul

H:Reverse transcriptase: 0.625ul

具体的操作是事先计算好需要的模板量,以及所要的RNase free water的量,在PCR小管中加好需要的模板量以及RNase free water的量,并将剩下的模板立即置于-80℃保存。再按照反转录的体系做好总的MIX,再分装到每个PCR小管内。将PCR小管置于PCR仪上反转,反转的具体程序如下: 25℃ 5 min ,42℃ 60 min ,70℃ 15 min. 4℃储藏

3、    反转录的cDNA作为real-time PCR检测的模板,由于real-time PCR检测灵敏性,要求每个样需要三个重复。每一个反应的用量如下:

1.                         SYBR 5.0ul

2.                         Primer mix 0.2ul

3.                         cDNA 1.0ul

4.                         water 3.8ul

4、在八连管中先加入模板,加入3.4ul的cDNA模板。

5、 根据需要检测样本的个数,计算所需要的SYBR、Primer mix、water量,具体的计算过程为:试剂单反应量X检测样本个数X3.4 ,根据计算需要的量制作MIX 。将MIX加入每个八连管的小管中。

6、    将对应的每个八连管的小管取出10ul加入96孔板,每个小管对应96孔板的3个孔,即3个重复孔。

7、  加完样品后,用专用的封膜覆盖96孔板,用专用的刮板覆盖严实。

8、上机检测。具体PCR程序如下:

1:50℃ 2 min ;

2:95℃ 5 min ;

3:95℃ 30 s ;

4:60℃ 40 s ;

5:72℃ 30 s ;

6:95℃ 15 s ; 60℃ 30s ;95℃ 15 s .

实验注意事项

1、由于real-time PCR的检测十分灵敏,因此它对RNA定量的准确性要求较高,一般RNA的定量多采用3复孔定量。

2、    无论在反转录或real-time PCR加样时要求加样一定要准确。

3、    在将八连管的mix加入96孔板前一定要充分混匀,一般采取的策略是将八连管一剪为二,置于Vortex上振荡混匀,Vortex的转速不要太高,以免将管内的液体溅到盖子内。

miRNA靶基因的鉴定

目前鉴定靶基因最直接的方法是, 利用荧光定量PCR及Western blot方法分别检测转染或敲低miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化, 从而确定miRNA与靶基因的对应关系. 这种方法可以大大提高准确率,但最终确定靶基因,还需要鉴定miRNA的靶位点. 而miRNA的靶位点的鉴定最常用的方法是荧光素酶报告基因法. 其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体, 将希望鉴定的miRNA靶基因的3?UTR构建到荧光素酶基因的3’UTR中, 然后将荧光素酶基因表达载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平, 最后检测荧光素酶的表达情况以分析转染3’UTR中是否含有miRNA的靶位点。

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