加载中…qPCR 引物篇（1）：普通PCR 和 qPCR 引物 是否一样？
(2016-03-17 12:34:08)
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qpcr引物篇普通pcr和qpcr引物是否一样 |
Q问题： 普通PCR 和 QPCR 引物 是否一样？
A
回答： 二者的设计原则有相同也有不同；
相同处：
• 序列的查找是一致的；
• 序列选取应在基因的保守区段；
• 选取合适的扩增片段大小
• 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；
• 避免引物自身形成环状发卡结构；
• Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；
• 引物之间的TM相差避免超过2℃；
• 引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；
不同处：
• PCR
产物长度；real-time PCR要求在300bp以内，一般首选80-150bp 之间；
• 多对目的基因同时扩增，文献上查来的引物条件会不同，需要设计尽可能条件一致的引物；
• 目的基因含量比较低时，需要设计灵敏度比较高的引物；
• 相对电泳法，Real
time PCR灵敏度比较高，对引物的要求更高，引物二聚体要少；熔解曲线要求单一产物；
• Real
time PCR的目的是进行定量或者相对定量，对扩增的效率有要求；对引物的二级结构要求高；
普通PCR
引物：
• 根据实验的要求不同，长度一般是从150bp到几千bp
不等；
• 对二级结构要求没有real
time PCR 高；
• 对扩增效率要求不高；
• 可以选用梯度PCR
仪，选择不同退火温度，对引物退火温度要求不需要一致；
验证时不同：
引物的特异性（相同点）：
Ø 引物的特异性在使用前用blast
来保证；
不同点：real time PCR
Ø 在实验结果中通过熔解曲线来验证；
Ø PCR的特异性产物峰应与引物报告中的PCR
product 相差在两度之内；
普通PCR
通过产物的长度，跑条带，来鉴别产物的特异性；
Real time PCR
可以通过扩增曲线，熔解曲线分析来鉴别产物的相对量，同时也可以对终产物进行电泳分析，更全面，更科学！
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