介绍

  20 世纪人们将电镜技术与免疫学方法相结合,逐步形成了免疫电镜检查术。1971年，Faulk和Taylor首次用胶体金标记抗体，取得了较满意的结果。1983年，Holgate等加以改进,将免疫金染色与银显影技术相结合,建立了免疫金银染色法(immunogold silver staining, IGSS)。近年来,胶体金标记技术得到进一步发展，已广泛应用于免疫转印、流式细胞术、液相免疫测定、固相斑点金/银、斑点金免疫渗滤及免疫层析。胶体金标记抗体技术的引入无疑是免疫电镜发展过程中的又一个里程碑。

特征性质 

  1原理

  胶体金是表面带负电荷的疏水性颗粒，颗粒之间的静电排斥力使它们在水溶液中保持溶胶状态。胶体金溶液呈红葡萄酒颜色，大颗粒胶体金溶液呈紫红色。氯金酸 （HAuCl₄）在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。

  2前提

  胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合而不影响蛋白质的生物特性。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。

  3机理

  免疫金标记技术 ( Immunogold labelling technique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉淀被放大，称之为免疫金银染色。

  4技术特征

  免疫胶体金技术是继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术，与现有其它标记方法和标记物相比，有以下特点：

（1）胶体金制备容易

（2）免疫胶体金对组织细胞的非特异性吸附作用小，几乎不出现非特异性吸附

（3）金颗粒大小可以控制，颗粒均匀，可进行双重和多重标记，即用不同大小的金颗粒分别标记不同的抗体，实现在在同一张切片上观察两种以上的抗原，也可以和其它标记物配合进行双重或多重标记

（4）既可用于光镜，又可用于电镜；既可用于透射电镜，又可用于扫描电镜

（5）可以标记多种生物大分子物质、如抗体葡萄球菌蛋白A（SPA）、凝聚素、多糖、多肽及其它蛋白质二不影响其生物活性

（6）由于胶体金本身有鲜艳的橘红色，可用光镜或肉眼观察实验结果，也可用分光光度计测定光吸收，进行定量分析。可在切片不同视野中根据金颗粒的数目来定量抗原

（7）灵敏度高，染色简便，不影响原有超微结构的观察，显色结果可长期保存

（三）我们平台对该项新技术的摸索

  我们现在对于胶体金技术的了解不是很深入，由于实验的需要目前主要针对细胞免疫胶体金标记工作，胶体金的合成简单但是纯度不高也不利于长期保存，所有我们主要从公司购买，价钱不贵，而且特异性也比较好。在标记的过程中我们根据之前对细胞免疫荧光标记的了解，对细胞免疫胶体金标记实验步骤进行了调整和条件的摸索。由于我们没有电镜系统，包埋过程还是交给大学电镜教研室。但是经过多次实验我们目前对于胶体金的免疫标记还是很有信心的，这样就可以弥补电镜室无法进行免疫标记实验的不足，也在我们原来光学显微镜的基础上，对细微结构有更好的认识，为院内免疫电镜相关方面提供技术服务。下面对我们的实验过程加以介绍。

1.免疫胶体金颗粒

  胶体金的制备一般采用化学还原法，可以方便地从氯金酸溶液中制备不同粒径（5~150nm）的胶体金颗粒。胶体金的粒径不同会呈现不同的颜色。常用的制备方法中以鞣酸-柠檬酸三钠还原法最为常用，它可根据需要制备出多种不同直径的胶体金颗粒，适用于多重标记。

  胶体金可用于标记许多生物大分子，如免疫球蛋白、卵白素、植物血凝素、脂蛋白、糖蛋白等。胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。肉眼观察是最基本也是最简单和方便的检定方法，但需要一定的经验。良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。结制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如0.02％NaN3）可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。

  制备了合格的胶体金以后，放在室温或4℃保存。避免低温冻存，因为冻存可导致胶体金凝集，破坏了胶体状态。胶体金在室温避光无灰尘的环境中可放置3个月左右。冰箱内半年左右，但根据胶体金的性质，有不稳定和聚沉的可能性，因此，制备完毕后最好在20天以内进行标记。

  我们从公司购买的胶体金颗粒，立即实验效果比较好，电镜下没有团块凝集，但是2个月后采用4℃保存的相同的胶体金进行实验，电镜下显示有较多的成团的胶体金，不能很好的判断实验结果，但不排除梅雨季节电镜包埋效果不好的原因，所以胶体金应尽量现用现配排除胶体金颗粒对实验的影响保证实验能够保质保量的完成。

  对于胶体金颗粒大小的选择。颗粒太小比如5nm以下，不便于电镜观察；10nm以上的胶体金颗粒过大，不利于穿透细胞膜，甚至穿透核膜在特定位置表达。所以在细胞实验胶体金颗粒大小的选择上我们首先选择的10nm大小，该大小很容易穿透细胞膜，不会因为颗粒过大穿膜剂使用过长对细胞结构造成影响。但是具体颗粒大小还是要针对不同组织或细胞实验需求进行条件摸索，好的实验结果是经过不断学习和实践共同努力的。

2.免疫染色

   免疫染色是免疫电镜技术中极为重要的一个步骤，其方法有包埋前染色，包埋后染色和不包埋染色三种。

  免疫反应在包埋前进行，然后再制成超薄切片，为包埋前染色。它是在固定前后未经其它化学试剂和高温聚合过程就完成了免疫反应，从而更好地保持了抗原性，有利于某些弱抗原的检出；其缺点是保存形态结构不理想，只适用于新鲜组织标本，由于抗体渗透性差，不易进行严格的对照研究。

  包埋后染色是先制成超薄切片再做免疫染色，敏感性高，重复性好，应用简便，节约抗体，形态结构保存好，并能在同一切片上作双重或多重标记；缺点是样品经前处理使抗原受到不同程度的破坏，不利于弱抗原的检出。

  我们选择是包埋前染色，对于抗原标记比较灵敏，但是我们也面对着包埋后电镜观察细胞结构不明显的问题，于是我们调整了实验过程，延长了固定时间，缩短了穿膜时间，既保留了细胞形态又不至于颗粒不能进入细胞内特别位置，还维持其抗原性。

3.实验过程总结

 a固定 细胞消化后离心，PBS洗3遍，弃上清，加入4%多聚甲醛37℃固定4小时。

 b穿膜 细胞PBS洗3遍，3%Triton-100重悬，37℃孵箱10分钟，PBS重悬，离心。

 c封闭 3%BSA重悬室温30分钟，PBS重悬，离心。

 d一抗 抗体4℃孵育过夜

 e PBS重悬，离心，二抗4度2小时，PBS重悬，离心，加入固定液，送标本电镜制备。

（五）应用

  胶体金免疫电镜技术已成为目前最常用的免疫细胞化学方法之一，它具有灵敏度高、特异性强、 定位精确等优点，同时它还可以对抗原进行定性、定量、定位的分析与观察。应用免疫金双重或多重标记法，可将形态、功能和结构的研究融为一体，有助于了解同一组织或细胞内不同分子间的相互关系，以及它们的合成、分泌、转运等代谢过程。

  对于探讨肿瘤的发病机制、诊断、鉴别诊断以及指导临床治疗有重要的意义。目前肿瘤病理主要根据显微镜下的形态改变而作出诊断。对良恶性病变和交界性病变往往缺乏客观尺，数量概念模糊，这种诊断容易受主观因素影响，在一定程度上干扰了诊断的准确性。据文献报道，一些肿瘤的误诊率达到20% ~40%。应用胶体金免疫电镜技术结合生物体视学和图像分析技术，探讨良恶性肿瘤和癌前病变病理形态的定量诊断方法，可望使诊断的正确率明显提高。例如，根据子宫内膜腺上皮体密度和表面积密度等指标的改变，对子宫内膜增殖症与中、高度分化的子宫内膜癌进行鉴别，显著降低了误诊率。运用类似的方法，同样可以对其他肿瘤进行分型、分级和鉴别诊断。因此，不断提高胶体金免疫电镜对肿瘤的诊断与研究技术，有利于今后更加深入地认识肿瘤 的发病机理及生物学特性，该技术必将在抗肿瘤药物的研究与开发、肿瘤的快速诊断体系的确立中发挥重要的作用。

  近年来，随着电镜技术的不断发展，极大地拓宽了其应用领域。免疫电镜技术为抗原亚细胞水平定位提供了有力工具。利用不同标记物在电镜下呈现不同的形态和电子密度的特点，可以建立了一些双标记或多标记免疫电镜技术，在同一系统中，同时观察不同抗原及受体在细胞表面和细胞结构中的定位。免疫学、分子生物学等知识和摄影技术、计算机技术和自动化技术等的渗入,使电镜的使用更方便，精确性和放大倍数更高，它在动物学、医学和微生物学中的应用更广泛，由此电镜反过来又推动这些学科的进步。但是电镜成本昂贵、操作和组成结构复杂，又具有高压和电子辐射等不利因素。随着科学技术的发展和实践经验的增多，这些不利因素将逐步克服，如原子显微镜能在空气、液体和真空中操作，从纳米水平提供三维图像，使电镜更好、更方便和更广泛地为人类服务。