测定蛋白质纯度的5个方法

　　蛋白质分离纯化的最后一个步骤是鉴定蛋白质样品是否均匀一致。但从目的蛋白质中检测出少量污染蛋白质远非易事，这是由于污染蛋白质的量可能低于其分析方法的检测极限，当用一种方法检验蛋白质纯度时，可能有两个或者更多的蛋白质表现行为类似，这种类似的表现行为可能会得出本来是混合物的样品却被认为是均一的错误结论。因此，只用一种方法作为蛋白质纯度检验的标准不很可靠，纯度鉴定应采用多种分析方法，从不同角度测定蛋白质样品的均一性。下面是几种鉴定纯度的方法。

　　1  电泳法

　　电泳法是蛋白质纯度鉴定最常用的方法。如果样品在凝胶电脓上显示一条区带，说明样品在其荷质比方面是均一的，可作为纯度鉴定酌一个指标。如果在不同PH下电泳，出现一条区带，说明样品的分子旦是均一的，因此只适用于含有相同亚基的蛋白质。

　　等电聚焦电泳是根据蛋白质等电点不同来分辨的，但在进行等电聚焦电泳时，蛋白质有时能和载体两性电解质结合改变其等电点，由于载体两性电解质是由多种不连续组分构成的，而在凝胶上会出现多条微小区带。如果等电聚焦凝胶上只出现一条区带，那么足以证明此蛋白质为均一蛋白质；但如果出现多条微小区带，不能证明该样品是不均一的。

　　含服的凝胶电泳用于鉴定在低离于强度下难溶的蛋白质纯度。样品首先溶解在腮中使其完全变性，然后按电荷和亚基大小进行分离。双向电泳对分析纯化酶来说。只需一向电泳就可以了。

　　2  通过层析性质的检测

　　当样品用线性梯度离子交换层折或分子筛层析分离时，若得到的组分是均一的，则各分织组分的比活力应当恒定。因此，可以通过层析组分具有相同的比活力，判定样品的层析性质是均一的。

　　3 免疫化学法

　　免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳、放射免疫分析等都是鉴定蛋白质纯度的有效方法。特别是放射免疫分析法发展迅速、应用广泛、几乎普及于生物体内各种微量成分的测定、灵敏度很高，但缺点是需要一定的设备。操作人员需经特殊训练，长期使用时，操作人员的保健与可能造成公害的废弃物的处理均存在问题。为克服此缺点，近年发展了以无害标记物取代放射性同位素的免疫法，如两标免疫分析、发光免疫分析和W咖Non吨等。

　　4  蛋白质化学结构分析法

　　随着蛋白质分析技术的改进，末端基团的测定方法等也逐渐用于蛋白质纯度的鉴定。对于一个纯蛋白质来说，通过N一末端的定量分析可以发现，每摩尔蛋白质应当有整数摩尔的N末端氨基酸。少量其它末端基的存在，常常表示存在着杂质。如果只是定性地测定N末端，那么此法就只适用于仅有一个脸镊的蛋白质。

　　对样品进行龙的氨基酸分析，也是检验纯度的一个方法。对一个纯蛋白质而言，应当发现所有的氨基酸都成整数比，如果含有捕助因子的话，辅助因子也应考虑在内。若有灵敏、精确、快速的氨基酸定量分析仪可供利用的话，此法常被用来鉴定蛋白质的纯度。其纯度标准，是唯一的氨基酸序列，但很少用它来鉴定纯度。

　　5 超速离心沉降分析法

　　凝胶电泳可检测出占主要成分1%的杂质，但有些样品不适于用电泳法分析。例如，脂蛋白和其膜束缚的蛋白质的电泳行为异常，而且其结构酌完整性需在去污剂存在下才能保持。这时最好用超速离心法。在离心管中若出现明显的分界线，或者分部取出离心管中的样品，管号对样品浓度作田，若组分的分布是对称的，则表明样品是均一的。此法的优点是时间短，用旦少，缺点是灵敏度较差，微量杂质难以捡出。

　　总而言之，检验纯度的最常用方法是电泳法。然后才是其它方法。如果对样品纯度的要求越高，则用来检验纯度的方法应当越多，而且对所得到的数据的解释超应当小心谨慎。