随着科技的发展，激光二极管的在生活生产中的运用随处可见，尤其高端技术的运用上可见一斑，下面为大家介绍下，激光二极管在激光扫描仪中的完美应用!

　　激光扫描显微(LSM)是生物科学中不可缺少的一种成像技术。今天我们将讨论共焦荧光成像、多光子激发荧光成像和二次、三次谐波成像技术。

　　任何显微镜的目的都是为了生成高对比度、高分辨率的图像。望远镜可以让科学家分辨出宇宙最精细的细节，与此相同，显微镜可以让我们以纳米的尺度观察生物机能。现代激光扫描显微镜能够生成多维数据(X、Y、Z、τ、λ)，其超高分辨率的成像能力促进了人们对基础生物学过程的理解。

　　LSM，特别是共焦激光扫描显微(CLSM)和多光子激光扫描显微(MPLSM)，能够对厚块状样品中的薄平面进行可视化，该技术被称为光学切片。在共焦LSM中，在焦平面以外样品产生的信号被一个光阑遮挡住，防止其被探测。多光子LSM，正如我们之后将讨论的，它不会生成任何焦平面以外的可探测信号。 通过将光学切片和焦平面的递增变化相结合，激光扫描显微技术能够产生厚样品的三维形貌。

　　光学切片是通过直接测量特定焦平面上产生的信号而生成的。在共焦LSM中，离焦光信号将被针孔光阑所遮挡，这样就可以得到更高的分辨率。相对地，在多光子显微技术中，只有焦平面位置的样品才会产生信号。每个光学切片的光信号都可以重新结合构成一幅三维图像。

　　生物样品往往没有良好的对比度，导致很难区分相邻结构之间的界线。改善激光扫描显微镜对比度的常用方法通过采用荧光照明的方法。在荧光照明中，发光分子用来将感兴趣的部分与背景或相邻结构区分开来。这种发光分子可以预先存在于样品中(内源性或自体荧光)，外涂并附加到样品组分上(化学构成或通过抗体结合)，或感染(荧光蛋白)到细胞之中。为了使分子发出光线(荧光)，分子必须先获得适当能量的光(光子)，从而使分子从基态变为激发态。当分子返回基态时，就会发出荧光。发出荧光的强度与入射激光光强(I)成比例，因此共焦LSM通常被认为是一种线性成像技术。在该释放过程中具有自然损耗，因此发射光子的能量较低，即，发射光子的波长比吸收光子长。

　　分子的多光子激发在两个或更多光子同时到达并且其能量总和满足跃迁能量时才会发生。 因此，到达的两个光子的能量将低于发射荧光光子的能量。多光子LSM技术还可以使用非吸收过程实现对比机制。在允许谐波产生的情况下，多个入射光子将同时湮灭并产生一个新的光子，其能量是之前所有光子的能量总和。通过观察谐波产生的物理顺序，我们可以进一步地分辨样品组分。在二次谐波产生(SHG)过程中，信号只在高度有序、缺乏反演对称性的组分中产生。三次谐波(THG)只能在折射率变化的边界界面才能观察到。双光子激发和SHG都是非线性过程，其信号的产生取决于光强的平方(I2)。多光子显微技术中信号产生的非线性特性要求光子的密度要比较高，这样才能进一步观察。为了克服这个问题，并且保持样品上相对较低的平均功率，模式锁定飞秒脉冲激光器，特别是钛：蓝宝石激光器，成为了标准的激发光源。

　　非线性显微技术中还需要考虑的另一个问题是某个特定荧光团对应的激发波长。通常情况下，理想的激发波长是单光子吸收峰值波长的两倍。对于大多数荧光团而言，但光子和双光子吸收对应的激发态选择规则是不同的。这样就导致双光子吸收光谱与对应单光子情形大不一样。双光子吸收光谱一般会非常宽(大概>100纳米)，并且不会平滑地遵循半高斯曲线。许多荧光团的宽双光子吸收光谱通过单个激光器促进了一些荧光分子的激发，这样就可以同时观察样品中几个兴趣组分。所有活跃的荧光团不必具有相同的激发峰，但它们的激发光谱之间应互相交叠并拥有相同的激发范围。多重荧光团激发通常通过选择一个能够以可接受的效率活跃所有荧光团的折中波长来实现。

　　事实上，光束并没有真正被聚焦为一个点，而是呈现一系列同心环，被称之为艾里斑。光斑的尺寸是艾里斑第一零级之间的距离(围绕同心环中心的第一个亮环的中心直径)， 并被称为一个艾里单位(AU)。

　　成像系统的横向分辨率是由将两个点分辨为两个不同个体所需的距离决定的。根据瑞利判据，这样恰好可分辨的两点应满足：其中一点最大光强对应的位置不能落在相邻点艾里斑的第一零级以内(即一个光斑的第一圆环恰好落在另一光斑的中心处)。有趣的是，在一个共焦显微镜中，横向分辨率只由激发波长决定。

　　这与宽场显微技术是相反的，宽场显微技术的横向分辨率只由发射博城决定。

　　理论上，共焦显微镜的总分辨率是激发照明点光源尺寸和探测针孔尺寸的函数。这表示光学系统的分辨率可以通过减小针孔的尺寸来提高。实际上，当我们限制针孔的直径时我们可以改善分辨率和共焦特定，但是，我们将减小探测器接收到的信号强度。1AU的针孔能够很好地平衡信号强度、分辨率和共焦特性。

　　我们应该注意的是，横向分辨率和轴向分辨率具有相同的光强决定特性，即激光功率越高，在衍射极限焦平面内产生信号的几率就越大。实际上，多光子显微镜的横向分辨率由照明光最终能被聚焦为多小的光斑所限制，并且在中等光强下可以由瑞利判据(公式2)进行较准确地估算。轴向分辨率会随着激发光功率的增加而持续减小。

　　图像显示

　　尽管我们不直接渲染一幅图像，但考虑像场尺寸、屏幕上显示图像(采集分辨率)的像素多少和成像系统的横向分辨率仍然十分重要。我们使用横向分辨率是因为我们需要渲染一幅表面图像。为了如实地显示光学系统能够分辨的最精细细节，我们必须适当地匹配分辨率(拍摄和横向)和扫描场。因此，我们的拍摄分辨率必须适当地对光学分辨率进行取样。在LSM中，我们一般依赖于奈奎斯特采样定理，该定理之处像素尺寸应该等于横向分辨率除以2.3。这表示如果我们采用先前的60X物镜，并且横向分辨率为297纳米(公式2)，显示图像的像素尺寸应约为129纳米。因此，对于1024 x 1024像素的拍摄分辨率，样品上的扫描场约为~132 x 132微米。应该注意的是，在我们之前例子中的40X物镜在样品中会有相同的扫描场(两种物镜具有相同的NA)。而两种物镜获得的图像之间唯一的区别为我们获取图像时扫描头倾斜的角度不同。在渲染图像时，有可能不总是需要这么高的分辨率。我们总是可以再图像分辨率、扫描场和拍摄分辨率之间找到一个折中的方案，从而在信号、样品寿命和图像分辨率之间进行平衡。

　　活体细胞成像中需要考虑的问题

　　LSM技术最引人注目的特性之一就是能够对活体细胞核组织进行成像。不幸的是，一些荧光的副产品可能具有毒性。正因为如此，产生高质量的图像和保持细胞活性之间有一种微妙的平衡。 荧光团饱和度是一个需要重点考虑的问题。 当增大激光功率不会带来荧光信号的预期同步增长时会发生荧光团饱和。只有10%的荧光团在活激发态时会发生这种情况。发生饱和是因为荧光团在被激发后回到基态需要一定时间。而荧光通路则相对较快(几百皮秒到几纳秒)，这只是指一次跃迁机制的时间。三重态转换和非辐射衰变则需要明显更长的弛豫时间。如果荧光产生较慢，细胞有其自身的内部机制来处理与荧光相关的细胞毒性。

　　减小光漂白和相关细胞毒性的一种方法是采用快速扫描的方式。若减少激光停留在图像上每个点的时间，探测信号的强度也会减小，通过使荧光团在激光扫描回之前扫描的点之前完全返回基态还会减少一些漂白过程。如果最快的速度不是关键问题，也可以平均几线或整帧图像来弥补更短积分时间造成的信号损失。

更长的激发波长和MPLSM的非退检测探测能力可以对生物组织中更深的位置进行成像。较长的波长不容易被样品散射，这是由于散射光强和波长的四次方成反比的缘故。典型的穿透深度约为250 - 500微米，但是，对于共焦LSM技术而言，已报道的成像深度最深可达1毫米。

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