荧光定量PCR原理

荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

qPCR可分为荧光染料法（SYBR Green 法为代表）和荧光探针法（TaqMan法为代表）。

荧光探针法（Taqman 技术）：TaqMan探针法qPCR是使用TaqMan荧光探针进行荧光检测的方法。其基础原理是PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。.该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号； PCR扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。

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TaqMan水解探针作用机理图

TaqMan探针法qPCR优点

特异性高、定量准确 — 荧光探针只与目的序列结合，理论上探针法的荧光信号只来源于目的序列，即不受非特异性产物的影响，因此，TaqMan探针法qPCR的特异性非常高，定量准确。

实验耗时短 — 探针法qPCR的高特异性，无需再设置熔解曲线检测扩增产物的特异性如何，大大缩短了实验时间。

多重反应可兼容，适用性强 — 不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针，因此可以在同一个反应体系中利用不同荧光标记的探针同时检测多个靶标，达到节省实验成本的目的。