加载中…[流式protocol] PI检测细胞周期（乙醇固定，Triton X-100打孔）
(2014-06-04 14:07:40)
标签：
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分类： 流式检测和分选 |
I.
材料
1、70% 乙醇，保存在–
20oC
2、 DNA
染色液（10ml，新鲜配制）的组成:
①Triton–X
100 10uL
②1mg/ml碘化丙碇
200uL
③DNase-free
RNase
2mg
④PBS
9.79ml
注：1mg/ml的PI储存液是由1
mg PI溶于1 ml蒸馏水中配制而成，可在0℃to 4℃保存数月。
如果RNase不是DNase-free，可将2 mg RNase A在1
ml蒸馏水中煮沸5分钟。
II.
步骤
1. 取1x10 6 细胞/管，PBS洗涤两次，每次250g离心5分钟。
2. 尽可能完全去除上清，加入1ml于－20℃
预冷的70%乙醇，注意， 要边振荡边加。
3. 标本保存于-20℃，直至要进行DNA染色（可保存数周至数月）
4. 染色当天取出标本，于250 x g
离心5分钟，尽可能完全去除上清，然后再用PBS洗涤1－2次，离心速度250g×5分钟。
5. 加入1
ml DNA染液，充分振荡，染色15分钟即可上机检测。
以上是比较快速的步骤您也可以先用RNAse作用30分钟（常温或37度均可），然后再用染色液孵育15分钟。
这几种作用方式结果无差别：http://www.flowcyto.cn/forum.php ... &pid=4794&fromuid=1
II.
1.
2.
3.
4.
5.
以上是比较快速的步骤您也可以先用RNAse作用30分钟（常温或37度均可），然后再用染色液孵育15分钟。
这几种作用方式结果无差别：http://www.flowcyto.cn/forum.php ... &pid=4794&fromuid=1
如果您的细胞经过GFP或EGFP转染，应该用以下的protocol
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[流式protocol]
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[流式protocol]
1、检测原理
为了使PI染色能够取得更好的效果，细胞通常需要用乙醇破膜，以使PI能够进入到核内。然而，用乙醇处理后，容易导致胞内可溶性的GFP在破膜后漏出，从而使GFP荧光降低或缺失。用固定剂（如多聚甲醛）虽然可以保留住细胞内的GFP，但是容易导致G0/G1峰的CV系数过大。
本方法通过固定/破膜同时检测GFP表达和DNA含量。首先细胞用1％多聚甲醛固定，然后以70％乙醇破膜，最后用含RNAse的PI染液染色。
2、标本
GFP转染的细胞
3、材料和试剂
• 5ml Falcon polypropylene Round-Bottom流式管 (12x75 mm)
• 冷却型离心机
• 37°C 水浴
• 40 μm尼龙滤膜 (BD Falcon Cell Strainer # 352340) or 70 μm 尼龙滤膜
• 无菌过滤的磷酸盐缓冲液(PBS), 4°C
• 固定液 (4°C)： 将2g高纯度多聚甲醛 (电镜级，Polysciences, 终浓度2% w/v)加入到100 ml PBS中。在通风橱中加热至70°C，直至多聚甲醛完全溶解（约1小时）。冷却至室温，调节pH值至7.2。避光保存在2°C－8°C。该溶液至少可稳定保存1个月，请定期检测pH值。
• 70%乙醇, -20°C
• 碘化丙啶(PI)溶液：
储存液：将1 mg PI (Sigma, P 4170)加至 1 ml dH2O，配成1 mg/ml的储存液。分成小管保存在-20°C，可保存2年。如果需要频繁使用，可避光保存在4℃，可保存2个月。如果PI溶液在室温中放置超过48小时，或颜色变成暗红色，则需要抛弃掉。一定要记住避光。
工作液：：将PI储存液用PBS以1：25的比例进行稀释，PI的终浓度为40 μg/ml.(原文中似乎未提及RNAse，可能老外忘了写，工作液的配制建议按照这个帖子配制：http://www.flowcyto.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=1330）
• RNAse A溶液：
将50 mg RNAse A (Sigma, R-4875)加至 50 ml PBS中，加入Tween-20,调节其浓度至0.1%。将溶液置于95℃水液30分钟。然后置于冰上1小时，通过0.2μm滤器过滤掉沉淀。溶液可在4℃保存6个月，或分成小管保存在-20°C.
4.对照
• GFP转染的细胞，不加PI
• 未转染GFP，未加药的细胞，加PI
5.步骤
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为了使PI染色能够取得更好的效果，细胞通常需要用乙醇破膜，以使PI能够进入到核内。然而，用乙醇处理后，容易导致胞内可溶性的GFP在破膜后漏出，从而使GFP荧光降低或缺失。用固定剂（如多聚甲醛）虽然可以保留住细胞内的GFP，但是容易导致G0/G1峰的CV系数过大。
本方法通过固定/破膜同时检测GFP表达和DNA含量。首先细胞用1％多聚甲醛固定，然后以70％乙醇破膜，最后用含RNAse的PI染液染色。
2、标本
GFP转染的细胞
3、材料和试剂
• 5ml Falcon polypropylene Round-Bottom流式管 (12x75 mm)
• 冷却型离心机
• 37°C 水浴
• 40 μm尼龙滤膜 (BD Falcon Cell Strainer # 352340) or 70 μm 尼龙滤膜
• 无菌过滤的磷酸盐缓冲液(PBS), 4°C
• 固定液 (4°C)： 将2g高纯度多聚甲醛 (电镜级，Polysciences, 终浓度2% w/v)加入到100 ml PBS中。在通风橱中加热至70°C，直至多聚甲醛完全溶解（约1小时）。冷却至室温，调节pH值至7.2。避光保存在2°C－8°C。该溶液至少可稳定保存1个月，请定期检测pH值。
• 70%乙醇, -20°C
• 碘化丙啶(PI)溶液：
储存液：将1 mg PI (Sigma, P 4170)加至 1 ml dH2O，配成1 mg/ml的储存液。分成小管保存在-20°C，可保存2年。如果需要频繁使用，可避光保存在4℃，可保存2个月。如果PI溶液在室温中放置超过48小时，或颜色变成暗红色，则需要抛弃掉。一定要记住避光。
工作液：：将PI储存液用PBS以1：25的比例进行稀释，PI的终浓度为40 μg/ml.(原文中似乎未提及RNAse，可能老外忘了写，工作液的配制建议按照这个帖子配制：http://www.flowcyto.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=1330
• RNAse A溶液：
将50 mg RNAse A (Sigma, R-4875)加至 50 ml PBS中，加入Tween-20,调节其浓度至0.1%。将溶液置于95℃水液30分钟。然后置于冰上1小时，通过0.2μm滤器过滤掉沉淀。溶液可在4℃保存6个月，或分成小管保存在-20°C.
4.对照
• GFP转染的细胞，不加PI
• 未转染GFP，未加药的细胞，加PI
5.步骤
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