流式分选是做亚群细胞必备的一个技术和平台。相比磁珠分选，流式分选的灵敏度和纯度要高些。
分选倒主要是操作上的问题，分选后的细胞活性、无菌等可能是技术难题！
转载：
流式分选注意事项
1.
安全性问题：由于在分选过程中，样本可能通过液滴震荡产生气溶胶，所以不接受会传播人类病原菌的生物有害样本，也不接受含放射性生物样品。
2.
应知道细胞的大小与形态，以便选择分选用喷嘴。所分选细胞的直径最好小于喷嘴直径的1/5，至少小于1/3。细胞的形态也会影响了分选的结果，理论上越接近于球形的细胞，分选过程中的剪切力对细胞造成的伤害就越小。形态特殊的细胞应选择较大的喷嘴，以减轻分选过程对细胞造成的伤害。
各种细胞的建议浓度和所用喷嘴如下表。
Table 1
细胞种类和浓度、喷嘴的选择
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Lymphocytes,
thymocytes or splenocytes (直径8-12
μm)
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Activated lymphocytes,
smaller cell
lines (直径12-20
μm)
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Large adherent
cell line (直径>20
μm)
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3.
荧光染料的选择：如选择1到4个荧光标记，一般按如下顺序选择，FITC、PE、APC和PerCP。
三、样本制备
使用者可依其需要使用各种不同的实验流程，如抗体荧光标定 (antibody labeling) 或荧光基因转染 (transfection)但在上机前必须完成下列程序：
1.
样品必需事先使用nylon
mesh (Cell Strainer,
mesh size: 40 µm, Falcon cat# 352340)过滤，或使用具有过滤功能之无菌管
(Falcon cat#
352235)，也可使用300目滤网过滤；同时必须去除红细胞。若因样品原因上机而引起机器堵塞及损坏，需负赔偿之责任。各种细胞的建议浓度如下表。
1.
样本制备基本流程：获取细胞悬液→荧光抗体染色→调整细胞浓度（参考Table
1）→避光置冰上运至分选室→移入带过滤头的流式管→上机检测并设定分选条件→试分选并上机检测纯度→分选细胞。
2.分选所用的细胞染色方法与分析所用方法基本相同，但需要注意以下几点：
a）保证样本的无菌状态，因为分选得到的细胞还要继续培养
b）不同使用固定剂固定细胞，因为活细胞经固定剂处理后即死亡
c）保证上机样品为单细胞悬液（我们提供带过滤头流式管 (Falcon Cat#
352235））
d）准备充足的细胞，详见FAQ3
e）分选缓冲液使用含2�S 或BSA的PBS，普通培养基中的酚红可能会干扰分选
f）如细胞分选后需再次培养，请准备含血清的收集管，在分选前交操作员。建议在15ml离心管中加入1-2ml血清及其它必需组分，保证分选完毕时血清浓度大于5%
g）如要分选GFP等转染的样品，请提供未经转染的相同细胞为阴性对照
h）如要做多重荧光染色标本的分选，请提供各种单一荧光染色的标本
i）如要去除死细胞，在不影响后续实验前提下，可以加入7-AAD或是PI
j）快速简便的样本处理有利于分选：处理好的样本尽快上机，分选好的细胞尽快下一步实验，如果要分选多个样本，建议一次处理一个，估计可能的上机时间后，再处理第二个样本
四.常见问题
Q1. 上机样品需要溶在何种溶液中？是否可以就直接放在原本培养的培养基中？
Ans: 建议不要放培养基中，因为Phenol
Red可能会影响分选的结果，可先尝试使用含2�S或BSA的PBS作为分选缓冲液。如要求更好的细胞存活率，按分选细胞的不同，选择不同的分选缓冲液。
1.淋巴细胞（HBSS配方中的阳离子可增进细胞的生存力。如果这些细胞并非易于群集细胞，可以选用没有EDTA的缓冲液）。
a)1 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0) and 0.5% -
2% BSA in 1× PBS (without Ca2+ and
Mg2+)
b)1× HBSS (without phenol red) with 1%
BSA
c)0.5% - 2% BSA in PBS(without Ca2+ and
Mg2+)
2.贴壁细胞（以Trypsin处理后去准备单细胞悬浮液时，待细胞变圆(切记不可过度作用)，以适量含5%血清培养液收取细胞，并均匀地打散细胞悬浮液。离心后，用分选缓冲液调整细胞浓度。如果需要的话可以提高EDTA的浓度(至5mM)以避免细胞重新黏聚）。
a）5 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0) and 0.5% -
2% BSA in 1× PBS (without Ca2+ and
Mg2+)
b）0.5-2% BSA in PBS(without Ca2+ and
Mg2+)
3.含有高比例死细胞的样本（这些配方可减少因死细胞释放出来的DNA所造成的细胞黏聚现象。）
5mM MgCl2, 1 mM EDTA,
25mM Hepes (pH7.0), 25-50 μg/mL DNAase I and 0.5% - 2% BSA in 1×
PBS (without Ca2+ and Mg2+)
4.建议询问有经验者（使用相同细胞进行过分选）的分选缓冲液配方
Q2. 如果细胞要再培养，会污染吗？
Ans: 分选所用的所有溶液都经高温高压灭菌，流式分选仪管路使用70%乙醇定期清洗，仪器所在房间在每次分选前紫外灭菌，最后在细胞培养基中加入抗生素，可将污染机率降至很低。
Q3. 如果我想在分选后拿到1×106的细胞我应该一开始准备多少细胞去做分选？
Ans: 假设你要的细胞只占总数的10%，则你所需准备的细胞数如下公式:
1×106=10%× 50%回收率×
20×106(起始细胞数)，所以你需要准备2×107细胞。高速分选、纯度模式(purity vs. yield
mode)、部分细胞黏附于上样管壁、部分
细胞用于样本分析、长时间分选过程中细胞的死亡等等，对会降低回收率。50%回收率是一个一般的参考值。
Q4. 通常做一次细胞分选需要多久时间？
Ans: 分选的过程有三个步骤，分别为设定分选区域、分选及分选后的分析。设定分选区域约需15-20分钟。分选的时间决定于细胞数目，虽然机器的分选速度最高可达70,000细胞/sec，但为得到最佳分选结果，我们通常设定分选速度为10,000-20,000细胞/秒。因此，如欲分选2×107细胞，其所需分选时间约为17-34分钟。分选后约需15-20分钟去分析及打印结果。所以，总共约需1-1.2小时去分选2×107细胞。
Q5. 一个样品可以同时分选出几种细胞?
Ans:
FACSAria可以从一个样品中最多同时分选出四种不同的细胞。
Q6. 可以同时使用多少参数进行细胞分选？
Ans:
FACSAria最多可以根据15个参数去定义及分选一群细胞 (检测488
nm 激光对应的5种荧光信号及SSC和FSC，监测633
nm 激光对应的2种荧光信号，检测375nm 激光对应的2种荧光信号，另有四个可扩充的空白通道)。
Q7. 分选后细胞的纯度有多少？
Ans: 通常可以达到95%以上的纯度，如果所分选细胞可以和其他细胞群较好的区分。
Q8. 如果阳性的细胞占总数的1%以下，还可以做分选吗？
Ans: 可以，但是低含量细胞的分选会导致低纯度及低回收率。因此，我们建议使用者事先富集你感兴趣的细胞。细胞富集的方式可以是正选：如用磁珠法富集你感兴趣的细胞；也可以是负选，如利用nylon
wool去除B细胞，或磁珠法去除不要的细胞。
Q9. 分选时所使用的管子有哪些？
Ans: 上样一般使用我们提供的带滤网5ml流式管；收集可以使用下面这三种管，15ml离心管(最多双路分选)，5ml带盖流式管(Falcon
tube #352003) (最多四路分选)，或1ml
Microtube(最多四路分选)。
Q10. 可不可以把分选后的结果文件带走？
Ans: 可以，提供FCS 2.0或3.0格式的流式分析结果，邮件发送或提供下载，进一步分析可使用免费软件WinMDI或商业软件Flowjo和FCSExpress软件。
2.
若细胞分选后需再次培养(无菌分选)，请准备含合适培养液之收集管，于分选前交操作员。建议在15ml离心管中加入8 ml的medium或在5
ml离心管中加入2
ml的medium当细胞分选时的垫底液(cushion)。
3.
若欲分选GFP，YFP或DsRed单色基因转染之样品，需提供未经转染的相同细胞为控制组标本，以作为分选前仪器校正之用。
4.
若欲以多重荧光染色执行分选，需提供各种单一荧光染色之标本作为分选前调整校正之用。
5.
本服务项目以无菌分选为主，委托服务者需提供无菌状态之样品。
三、申请流程与注意事项：
流式细胞分选服务流程
步骤一：预约申请
1.
预约时间：开放预约时间期限为前1周.
2.
时间： AM
10:00-11:30，PM
1:30-4:00。
3.请预约者务必准时上机，未能在预约时段开始30分钟内将样品准备好并完成上机者则视同弃权并记一次违约 (譬如预约时段为10:00-11:30，请于10:30前准备好样品并上机)。
4.
取消预约：最迟请于预约时段前一天取消预约，否则记一次违约。
5.
同一使用者若违约累计三次，则禁止此使用者使用此服务一个月。
步骤二：先以分析型流式细胞仪确认样本
1.本仪器仅限于为无菌细胞分选。
2.
分析样品者请使用FACSCalibur或其它流式细胞仪
步骤三：上机日也请携带一片光盘片(CD-ROM)以便带回分选后的电子文件。
四.常见问题及答复
Q1.
上样样品需要溶在何种溶液中呢？是否可以就直接放在原本培养的medium呢？
Ans:
建议不要放medium中，因为Phenol
Red会影响分选的结果，一般建议放置于Sorting Buffer，配方如下:
Sorting Buffer:
• 1 ×
Phosphate Buffer Saline or HBSS (Ca/Mg++ free)
• 1 mM
EDTA
• 25 mM HEPES
pH 7.0
• 1 % Fetal
Bovine Serum (Heat-inactivated)
• 0.2 mm
sterile filtered, store at 4℃
依分选之细胞不同，Sorting
buffer可稍做调整，其方式如下列所示:
淋巴细胞：
1x HBSS(with Ca++/Mg++)含1% FBS
HBSS配方中的阳离子可增进细胞的生存力。由于这些细胞并非易于群集细胞，即便配方中没有EDTA也不会造成问题。
较黏着的细胞(sticky
cells)：
提高EDTA 到 5mM 并使用透析过的FBS (against Ca++/Mg++ free
PBS)。某些细胞在活化会比较黏着而EDTA可抑制此作用。
贴壁型细胞株(Adherent
cells)：
以Trypsin处理后去准备单细胞悬浮液时，待细胞变圆(切记不可过度作用)，便以5 ml
含5%血清培养液收取细胞，并均匀地打散细胞悬浮液。离心后，用sorting buffer调整细胞浓度。如果需要的话可以提高EDTA的浓度(至5mM)以避免细胞重新黏聚。
含有高比例死细胞的样本：
Sorting buffer加5mM MgCl2以及25~50 μg/mL DNAase I (Sigma D-4513)或是Sorting buffer加0.83mM MgCl2以及20 U DNAase II (Sigma
D-4138)。这些配方可减少因死细胞释放出来的DNA所造成的细胞黏聚现象。
(资料来源http://facs.scripps.edu/SortLink/buffer.htm)
Q2.
如果细胞要再培养，会污染吗？
Ans:
目前机器会在分选前会固定做清洗，但是因为仪器所处环境仍非无菌，故建议带来要接收分选细胞的medium要加入抗生素，以减低污染之机率。
Q3.
如果我想在分选后拿到1x106的细胞我应该一开始准备多少细胞去做分选？
Ans:
假设你要的细胞只占总数的10%，则你所需准备的细胞数如下公式: 1x106=10%x 50%回收率x 20x106 (起始细胞数)，所以你需要准备2x107细胞。分选速度、方式(purity vs. yield
mode)及细胞在分选前状况的好坏都会影响回收率。50%回收率是把所有因素都列入考虑的最低参考值。
Q4.
通常做一次细胞分选需要多久时间？
Ans:
分选的过程有三个步骤，分别为设定分选区域、分选及分选后的分析。设定分选区域约需15-20分钟。分选的时间决定于细胞数目，虽然机器的分选速度最高可达70,000细胞/sec，但为得到最佳分选结果，我们通常设定分选速度为10,000-20,000细胞/sec。因此，如欲分选2x107细胞，其所需分选时间约为17-34分钟。分选后约需15-20分钟去分析及打印结果。所以，总共约需1-1.2小时去分选2x107细胞。
Q5.
一个样品可以同时分选出几种细胞?
Ans: FACSAria可以从一个样品中最多同时分选出四种不同的细胞。因此positive和negative的细胞也可以同时分选出来。
Q6.
可以同时使用多少参数进行细胞分选？
Ans: FACSAria最多可以根据11个参数去定义及分选一群细胞 (488 nm laser可侦测5种荧光讯号及SSC和FSC，633 nm
laser可侦测2种荧光讯号，375nm可侦测2种荧光讯号)。
Q7.
分选后细胞的纯度有多少？
Ans:
通常我们会预期95%以上的纯度如果positive的细胞占总数的5%以上。
Q8.
如果positive的细胞占总数的1%以下，还可以做分选吗？
Ans:
可以，但是低含量细胞的分选会导致低纯度及低回收率。因此，我们建议使用者事先enrich你有兴趣的细胞。细胞enrichment的方式可以利用nylon wool去除B细胞，panning或是用magnetic beads (from StemCell or
Miltenyi)去除不要的细胞。
Q9.
分选时所使用的tube有哪些？
Ans:
可使用15ml离心管(单或双向分选)或5ml无菌管(Falcon
tube #352003) with snap cap (三或四向分选)。
Q10.
可不可以把分选后的电子文件带走？
Ans:
可以，由于此细胞分选仪使用FACSDiva软件(PC界面)做分析，我们必须把结果用FCS格式输出，使用者拿回数据后可以利用FCS converter将FCS转换后用CellQuest软件(Apple界面)或其它软件做分析。
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