最先获得的转基因哺乳动物就是使用显微注射法，1981年Gordon等报道了用显微注射法将外源基因注入小鼠受精卵中得到了转基因小鼠。尽管发展最早，直到目前，仍然是使用最为广泛、最为有效的方法之一。

    在技术上，二十多年来，显微注射法普遍使用，由于过程较为单一、流程化，因而并无太大的改变。利用这一方法建立转基因动物的大体过程如下：在两个原核还没有融合时收集受精卵、将外源基因的构建体经显微注射到受精卵雄性原核、注射过的胚胎经体外培养或不经体外培养、移植入假孕动物、通过分子生物学手段鉴定子代，如图所示。小动物均使用超排卵和代孕动物。

    近年来，在进行大型动物的转基因研究中，由于费用及受精卵少等原因，打破以往准备供体动物和受体动物的惯例，而采用受精卵注射外源DNA后自体移植的做法。另一方法是采用体外培养的卵母细胞和体外受精，经注射后培养至囊胚期，再移植到受体动物。由于大型动物价值高，为了确保移植胚胎含有外源基因，人们采用许多方法期望在体外培养时能鉴定出是否整合外源基因，常规的PCR不能确定外源DNA是否整合到受精卵染色体上，最好的方法是将标记蛋白基因与目的基因一起注射到受精卵，虽然有时选择的胚胎仅整合标记基因，而目的基因被排除了，但这种方法仍然是减少受体动物数目最实用的。绿色荧光蛋白现在认为最理想的标记蛋白，其主要优点是不用入侵的方法就能观察到。与此同时，如何提高转基因动物的阳性率，一直是人们不断追求的目标，这在大型动物研究上显得尤为重要。现在常用的改进是胚胎分割技术，即将注射后的受精卵培养6~8天形成囊胚，再将囊胚切成两半，一半做PCR检测，阳性的囊胚再做胚胎移植，以此提高阳性率。另一种方法是分离分裂球，用荧光原位杂交(FISH)观察目的基因是否整合。当然使用体外熟化的卵母细胞在体外受精的受精卵，其存活率低一些，并需要相应技术支持。

    为了提高外源基因的整合率，有人将精子用温和的去污剂处理后与外源DNA共培养，进行精子显微注射受精，只需要将携带外源DNA的精子注射到卵母细胞胞浆(ICSI)即可，结果证明这种方法效率很高。这种的效率很大程度取决于ICSI技术。

这一目前广泛使用的方法的优点是：外源基因的长度不受限制，可长达数百kb，特别是对于大片段的转基因，能保持转入片段的完整性；常能得到纯系动物，实验周期相对较短。

与此同时，这一技术的一些不足也限制了它的应用，总的来说外源基因整合效率不高，且因操作的熟练程度不同差别很大，从不足1%~30%；需要昂贵精密的设备且技术复杂，需要专门的技术人员；导入的外源基因拷贝数无法控制，常为多拷贝；可导致插入位点附近宿主DNA大片段缺失、重组等突变，可造成动物生理缺陷；外源基因的整合是随机的，故整合率不能控制；外源基因的表达受到插入位点的染色休微环境的影响，常导致基因沉默和低表达，即位点效应；有些动物的原核不易看清楚，如大鼠、猪、山羊等，需经特殊处理，才能有效导入；特别是用于制备转基因大型动物时，转基因的效率较低，需要较多的供体和受体动物。