当然知道基因敲除是指基因在功能上的消失，而对具体的转基因动物（小鼠）染色体组可能是变大的。但是笔者没有见过具体文献描述所以没有自信，今天看书的时候突然看到相关内容，拿出来大家分享。

首先克隆一段含有待敲除的小鼠基因的DNA，然后用新霉素抗性基因插入其中，断开这一靶基因，在克隆基因的其他部位(靶基因之外)引入一个胸苷激酶基因(tk )。这两个额外基因将用于后面剔除未发生定向敲除的克隆子。

接下来，将构建的小鼠DNA与褐色小鼠的胚胎干细胞(EM细胞)混合。这些干细胞可以分化成任何类型的小鼠细胞。在其中一小部分细胞中，被断开的基因通过某种途径进入细胞核，并与细胞中同源的野生型靶基因之间发生同源重组，从而使断开的靶基因进入小鼠基因组，并移去胸苷激酶基因(tk)。遗憾的是发生这种重组的概率非常小，许多干细胞不发生重组因此不受靶基因被断开的干扰。还有一些干细胞会发生非特异性重组，被断开的基因随机插入到基因组中而没有替换相应的野生型基因。

那么如何剔除未发生同源重组的细胞呢?该是先前引入的额外基因发挥作用的时候了。未发生重组的细胞没有新霉素抗性基因，因此在含有新霉素衍生物G418的培养基上培养细胞就可以将其剔除。而发生了非特异性重组的细胞，tk基因随断开靶基因一同进入细胞的基因组中，用一种能杀死tk⁺细胞的药物gangcy-clovir杀死这些细胞(我们用的干细胞是tk^- )。

用这两种药物处理后，剩下的就是发生了同源重组的工程细胞了，而且是含有断开基因的杂合子细胞。

下一个任务是将这些断开的靶基因导入完整的小鼠体内。做法是将得到的工程干细胞注射到最终要发育成黑鼠的胚泡中。  由于ES细胞可分化成任何类型的小鼠细胞，因此工程干细胞也可以像正常胚泡细胞一样，形成胚胎并能植入代孕母鼠，最终生出嵌合体小鼠。通过花斑体色可以鉴别嵌合体小鼠，黑色条纹来自原初的黑鼠胚胎，棕色条纹来自移植的工程细胞。

为了获得真正的杂合体小鼠而不是嵌合体，待嵌合体小鼠成熟后将其与黑鼠交配。由于褐色(鼠灰色)是显性性状，所以子代中自然有褐色小鼠。实际上，所有由工程干细胞的配子发育成的子代小鼠都是褐色的。由于工程干细胞是敲除基因的杂合子，所以只有一半的褐色小鼠携带有断开基因。Southern印迹显示在我们的实验中有两只褐色小鼠携带断开的基因。将它们交配后在子代小鼠中检测DNA，寻找基因敲除的纯合子小鼠。在本例中，交配后得到了一只基因敲除的纯合子小鼠。现在的任务是观察其表型。表型经常并不显著，但是无论显著与否都是非常有指导意义的。

有时基因敲除是致死性的，受影响的小鼠胎儿在出生前就已死亡。还有一些基因敲除表现出中间效应。例如，肿瘤抑制基因p53，缺失此基因的人极易患上某些癌症。p53基因敲除小鼠能够正常发育，但是在幼年期就会受肿瘤之苦。