DNA在复制时，首先需要将两条链解开，因而会产坐扭曲张力。早期曾认为DNA分子可通过旋转而消除这种张力。然而一条很长的DNA双螺旋分子进行高速的旋转，这是不可思议的。通过对DNA的拓扑结构和拓扑异构酶的研究，现在已能较好了解DNA在复制时双链是如何解开的。

1966年Vinograd和Lebowitz在研究闭环DNA的空间关系时提出了以下公式:

α=β+τ

其中α为双链闭环中两条链的互绕数，或称为拓扑连环数；β为DNA的螺旋圈数(或绕数);τ为超螺旋数，亦即拧数。当双链闭环的两条链保持连续时，α值不变，β值只与DNA分子的碱基对数目和构象有关，B型DNA的β值为碱基对数目除以10。α值减β值之差即为超螺旋数τ。α值必定是整数，β值与τ值不一定是整数。α与β的正负表示螺旋方向，右手螺旋为正，左手螺旋为负；τ的正负则表示α大于还是小于β，即双链闭环的螺旋圈数增加还是减少。

超螺旋数目是以整个环状DNA分子为单位的，为便于比较，需引入另一个概念——比超螺旋，或称为超螺旋密度。以符号δ来表示:

δ=（α-β）/β

生物体内的DNA分子通常处于负超螺旋状态。从热力学上考虑，超螺旋DNA处由较高自由能状态，因此如果DNA的一条链有一个切口它即自发转变成松弛态负。超螺旋状态有利于DNA两条链的解开，而DNA的许多生物功能都需要解开双链才能进行，生物体内可通过DNA不同的负超螺旋结构来控制其功能状态。

除连环数不同外其他性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构反应的酶称为拓扑异构酶。DNA拓扑异构酶通过改变DNA的α值而影响其拓扑结构。拓扑异构酶可分为两类:类型的酶能使DNA的一条链发生断裂和再连接反应无需供给能量；类型的酶能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要ATP供给能量。

类型拓扑异构酶首先在大肠杆菌中发现，过去称为ω蛋白或转轴酶。后统一称为拓扑异构酶。大肠杆菌的酶为分子量110000的一条多肽链，由基因top所编码，该基因突变将导致DNA负超螺旋水平的增加，并影响到转录活性。原核生物的拓扑异构酶I只能消除负超螺旋，对正超螺旋无作用；每次作用改变的α值为+1。真核生物的拓扑异构I对正负超螺旋均能作用。除消除超螺旋外，拓扑异构酶还能引起DNA其他的拓扑转变。

当大肠杆菌的拓扑异构酶与DNA结合时，可形成稳定的复合物。分析此复合物的结构发现，DNA的一条链断裂，并且具5`-磷酸基与酶的酪氨酸羟基基形成酯键。在此发生的是磷酸二酯键的转移反应，由DNA转移到蛋白质。随后使原来断裂的DNA链重新连接，即磷酸二酯键又由蛋白质转到DNA。整个过程并不发生键的不可逆水解，没有能量的丢失。因此DNA链的断裂和再连接并不需要外界供给能量。拓扑异构酶在使DNA的一条链断裂的同时，可牵引另一条链通过切口，然后使断链重新连接，从而改变DNA的连环数和超螺旋数。

细菌的DNA旋转酶是一种类型的拓扑异构酶，它可连续引入负超螺旋到同一个双链闭环DNA分子中去，每分钟引入大约100个负超螺旋。反应需要由ATP供给能量。在无ATP存在时，旋转酶可松弛负超螺旋，但不作用于正超螺旋，而且松弛负超螺旋的速度比引入负超螺旋的速度慢10倍。

旋转酶的作用机制：当酶结合到DNA分子上时，可同时使两条链断裂，2个A亚基分别与5`-磷酸基结合，在酶构象改变的牵引下，另一双链穿过切口，然后断裂的2条链又重新连接。每次反应改变的连环数为-2。ATP水解产生的能量用来恢复酶的构象，从而可进行下一次循环。

拓扑异构酶和广泛存在于原核生物和真核生物。细胞内的定位分析表明，拓扑异构酶主要集中在活性转录区，同转录有关。拓扑异构酶分布在染色质骨架蛋白和核基质部位，同复制有关。拓扑异构酶可引入负超螺旋，拓扑异构酶可减少负超螺旋，它们协同作用控制着DNA的拓扑结构。复制时需要较高水平的负超螺旋，复制结束后需要降低负超螺旋水平，以便在活性染色质部位进行转录。拓扑异构酶在重组、修复和其他DNA的转变方面也起着重要的作用。

DNA拓扑异构酶引入负超螺旋，可以消除复制叉前进时带来的扭曲张力，从而促进双链的解开。而将DNA两条链解开，则有赖于DNA解螺旋酶。这类酶能通过水解ATP获得能量来解开双链，每解开一对碱基，需要水解2分子ATP成ADP和磷酸盐。分解ATP的活力要有单链DNA的存在。如双链DNA中有单链末端或缺口，解螺旋酶即可结合于单链部分，然后向双链方向移动。大肠杆菌解螺旋酶I、和I可以沿着模板链的5`向3`方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿3`向5`方向移动。这两种解螺旋酶的配合作用推动着DNA双链的解开。

解开的两条单链随即被单链结合蛋白（SSB)所覆盖。值得指出的是，这一蛋白实际并非DNA解链蛋白，它的功能在于稳定DNA解开的单链，阻止复性和保护一单链部分不被核酸酶降解。

原核生物的SSB蛋白与DNA的结合表现出明显的协同效应，当第一个蛋白结合后，其后蛋白的结合能力可提高1000倍。因此一旦结合反应开始后，它即迅速扩展，直至全部单链DNA都被SSB蛋白覆盖。从真核生物中分离到的SSE蛋白没有表现出这种协同效应，可能它们的作用方式有所不同。