加载中…半保留复制模型的验证
(2013-04-11 22:41:36) | 半保留复制模型的验证 | ||||
| BIOX.CN | 2005-7-7 9:29:38 | 来源：生命经纬 | ||
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Watson 和Crick发表了DNA双螺旋模型之后不久，于同年又紧接着发表了DNA半保留复制的复制机理，这一建立在碱基互补基础上的机制为转录、修复、重组、分子杂交等奠定了基础。他们提出半保留复制之前，普遍认为“蛋白质和核酸是彼此互补的，DNA自我复制过程是通过核酸和蛋白质的交替合成”。但Watson 和Crick认为：“DNA自我复制并不依赖于特异的蛋白质的合成，DNA双螺旋中的每一条互补DNA链，在合成它的一条互补新链时都可以作为模板”。复制时“连接互补链的氢键必须断裂，两条链还必须解缠和分离。很可能这种单链本身可以呈螺旋构型，并作为模板，游离的核苷酸（正确的多核苷酸前体）通过形成氢键自动地结合到它上面”。这就是DNA复制的半保留模型（semioconservetive model）。
一、Meselson-Stahl实验< xmlnamespace prefix ="o" ns ="urn:schemas-microsoft-com:office:office" /> 半保留复制模型于1953年就已经提出，直到1958年Meselson-Stahl才用实验证实其正确性，可见事情并非容易。尽管很多学者都对这方面的工作十分热衷，因为作出的成果有可能称为证实或否定半保留复制的重要实验证据。可是却料想不到实验材料相当困难，因为一定要创立一个能量度出个体DNA分子微小放射性含量的方法才行。直到1957年才获得了方法上的突破。M. Meselson和F. W. Stahl采用稳定的同位素15N作DNA标记，而不用32P和14C（放射性同位素），15N会导致DNA分子密度显著增加。这样可以通过密度梯度离心将亲本链和子代链区分开来。他们将E.coli放在含有15N的培养基上生长，使亲代的DNA双链都标记上15N（重链），若提取DNA进行CsCl梯度离心应只有一条带位于离心管底部，紫外吸收光谱只出现一个大峰。然后再将持续生长的后代放在含14N的培养基中生长，使新合成的链中所含的N原子皆为14N（轻链）。若是半保留复制应只出现一种“杂种链”，有15N标记的亲本链和14N标记的子链互补而成；而若是全保留复制应有两种双链，亲代双链皆由15N标记，新合成的链有14N标记；若是按分散型也只会产生14N和15N相同排列的一种双链。实验结果显示离心管中只出现一条带，位于中部，紫外吸收峰也出现一条中等峰。表明半保留复制模型是和实验结果完全吻合，全保留模型可以排除但分散模型却不能排除；将持续生长的E.coli再放入含14N的培养基中培养，按半保留复制模型应有两种双螺旋，一种由含14N / 15N组成的轻链，另一种是由轻链和重链组成的杂种链。这两种链的数量相等；若按全保留复制，预期也会产生两种链，但和前者不同，一种是完全由轻链组成的双链，另一种是完全由重链组成的双链，轻重之比为3：1；若按分散模型，第二代子链都是轻重相间排列，仅轻链片段比例要多于重链片段，所以预期仅一条带位于中上部。实验的结果是离心管中持续两条带，比例相等，一条位于上部（轻链），一条位于中部（杂种链），紫外吸收也相应持续两个峰，此也完全符合半保留复制，而彻底排除分散模型。虽然按全保留复制也只产生两条带，但比例和位置都不符合，结合第一步实验也可完全排除。从而十分信服地证实了DNA半保留复制是完全正确的。
Meselson等还做了第二项实验，就是将第一代的14N / 15N杂种链经变性将双链分开，然后再将变性前后的双链和单链分别进行CsCl密度梯度离心。变性前杂种双链只有一种带，密度为1.717克/厘米3，变性后两条单链的密度不同，因而呈现了两条带，一条为15N带，（1.740克/厘米3），另一条为14N带（1.725克/厘米3）。而同时进行作对照的样品是从肺炎球菌（D. pneumoniae）中提取的DNA，变性前后都只有一条带，密度为1.700克/厘米3。这一结果完全符合半保留复制预期的结果，并彻底否定了“分散模型”和与之类似的末端相连保守模型（end-end conservative），这两种模型的第一代子链和半保留模型难以区别，但通过变性其两条单链的结构相同，故预期和肺炎球菌一样只能出现相同的一条离心带，但实验结果却是两条带。 |
二、Taylar实验
1958年Herbert Taylar用3H标记蚕豆根尖细胞的DNA，通过放射自显影证实了真核生物的DNA复制也符合半保留模型。
每一条染色单体是由一条DNA 双链组成，按半保留复制机制，Taylar预期用3H标记蚕豆根尖细胞的DNA到第二周期后不再用标记。经放射自显影后第一周期的中期（M1）染色体中的两条单体都被标记；到第二周期的中期（M2）染色体中仅一个单体被标记；到第三周期的中期（M3）时，染色体有两类：一类是染色单体都未标记，另一类是有一个染色单体被标记，两类染色体比例相等，这一结果和预期的情况完全符合。
三、姐妹染色单体差别染色方法（sister-chromatid differential staining）
真核生物的半保留复制也可用现代技术姐妹染色体色差方法加以证明。在复制过程中用胸苷尿嘧啶的类似物5溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxy uridine，简称BUdR）可以掺入到新合成的DNA中。无论在何时，新合成链中的T被BUdR所取代。这样母链中含有T，而新合成的链中含的是BUdR。若用荧光染料染色的话，正常链和T－BUdR杂种链都可以染色，但含BUdR的双链是不能染色的，这样在荧光显微镜下可观察到两条姐妹染色单体的荧光强弱不同。1974年Korenberg和Freedlender改进了这一技术，在掺入BUdR后经紫外光的照射，可损伤含有BUdR的双链，这样再用Giemsa染色，只有含T双链或T－BUdR杂种链可被染色，而BUdR双链则因DNA破坏染不上色。这样在培养的第三周期中期染色体的两个姐妹染色单体不同，一个染上深紫色，另一个不染色，故称之为斑色染色体（Harlequin chromosome）。和前面的道理一样，这种差别染色也能很好地证实真核DNA的半保留复制。现在这种方法又被应用于三致物质（致癌变、致畸变、致突变）的检测，方法是通过第三周期中期染色体的姐妹染色单体交换（sister chromatin exchage）频率来决定。
四、Cairns复制模型
Meselson和Stahl的实验虽然有力地证明了半保留模型，但还有一些问题需要解决：在原核基因组中复制是沿着环状DNA先后逐步完成的，还是在很短的时间里同时完成的？显然DNA合成是一个逐步的过程，那么为什么实验中未出现某一片段上只有一半复制了，还有一半未复制呢？即存在轻的和重的分子联合存在的片段。为了解决这一问题，1963年Cairns设计了另一实验。他将细菌E.coli放在含有标记的T的培养基中培养，新合成的DNA链中含有放射性，按半保留复制模型，培养一代后产生的环状子染色体中应有一条单链是被标记的。那么继续在含培养基中培养1代时，第二轮复制已经开始，每个环状染色体含3H的部分如图11-7所示，此时将溶菌酶缓慢裂解细胞壁，以提取完整的环状DNA放到透析膜上，再固定在载片上，罩上照相底片后置于暗处二月，进行放射自显影，由于释放出的粒子可使照片底片曝光，显示出标记的部分。在电镜下观察、摄影，获得了θ（theta）结构。因此现在对环状染色体的半保留复制也称θ型复制。实验结果首先证明了Jacob和Wollman（1957年）有关E.coli基因组为圆形排列的推断。第二轮尚未复制的部分（ABC）已标记了一条链，叫做热（hot）链，未被标记的是冷链，放射自显影图中是显示不出的。这表明复制却是是半保留的。第二轮复制时只有部分环进行了复制，形成了复制叉（replication fork），其模板一条是未标记的亲代链（AEC），另一条是第一轮新复制的被标记的链（ADC），所以第二轮复制时，ADC两条链都被标记过，显影较深，AEC只有一条链含3H，显影较浅。这样不仅证明了半保留的正确性，还显示了环状DNA复制时的拓扑学形态，表明复制是有一定顺序的，在一轮复制未完成前，DNA有的部分已复制，有的部分尚未复制，这是Meselson-Stahl实验所没有解决的问题。用这张照片可以直接度量出E.coli基因组的大小（全长为1100μm），而每个螺旋长34埃（3.4×10-3μm），含10个，因此E.coli的基因组含有1100÷（3.4×10－3）×10＝3.2×106（bp），根据实验结果进一步推论E.coli复制周期有一个固定的起始点；复制是单向进行的。以后的实验进一步证明第一个推论是正确的，而第二推论却未能言中。
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