一、实验目的

　　1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。

　　2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。

　　3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。

　　4. 学习平板菌落计数法。

二、实验原理

    将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。

　　要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。

表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求

　三、实验材料

　　1. 菌源土样

　　2. 培养基    牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。  

　　3. 无菌水    250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。   

　　4. 其他物品    无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。

（一）系列稀释平板法

　　1. 取土样 

    选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。同时取10～15g，称重后经105℃烘干8h，置干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。

2. 制备土壤稀释液 

    称土样1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次，摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。

　3. 接种 

    分离不同的微生物类群采用不同的稀释度，参考表2-1进行选择。

    从稀至浓分别吸取各浓度稀释液1mL于各平皿中（每个稀释度每种做2-3个培养皿，并注意做好浓度及培养基种类标记），同时做空白对照，倒入熔化后冷却至45℃～50℃左右的相应培养基，轻轻地摇动并旋转平皿，使菌悬液与培养基混合均匀，水平静置待凝，倒置于相应温度的培养箱中培养，2～5天后，观察菌落情况及计数。

1.包装纸套中取出无菌移液管；2.安装橡皮头，勿用手指触摸移液管；3.火焰旁取出土壤悬浮液；4.灼烧试管口及移液管吸液口；5.在火焰旁对试管中土壤悬浮液进行稀释；6.用手掌敲打试管，混匀土壤稀释液；7.从最小稀释度开始，将稀释液加入无菌培养皿中；8.将融化冷凉至45～50℃培养基倒入培养皿内；9.用毕的移液管装入废弃物缸中浸泡消毒后灭菌洗涤

　4. 培养

    冷凝后，将平板倒置于在各自适宜的温度下培养，培养一定时间后观察。

　　5. 计数 

    选菌落单个分散、菌落数适量且各平行皿数量接近的稀释度的平皿计数。通常细菌和放线菌选取菌落数在30～300之间的平皿，霉菌选菌落数在10～100之间的平皿，最后换算成每克干土所含菌数，记录于表2-2。

表2-2  样品中四大类微生物的菌落数

（二）涂布法分离（酵母菌定量分离用）

    依前法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至45～50℃的马铃薯葡萄糖培养基，待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取三个不同稀释度菌悬液0.1mL，依次滴加于相应编号已制备好的马铃薯葡萄糖培养基平板上，右手持无菌玻璃涂棒，左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。

（三）平板划线法

    取各平板一只做好标记，将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸一环10-2土壤稀释液，按图2-4和图2-5的方式在培养基表面轻轻划线，注意勿划破琼脂。划线完毕，将培养基倒置培养，2～5天后，挑取单个菌落，并移植于斜面上培养。如果只有一种菌生长，即得纯培养菌种。如有杂菌，可取培养物少许，制成悬液，再做划线分离，有时要反复几次，才能得到纯种。

（四）平板菌落形态及个体形态观察

    从不同平板上选择不同类型菌落观察，区分细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态特征。再用接种环挑取不同菌落，在显微镜下进行个体形态观察。将所分离的各类菌株的主要菌落特征和细胞形态记录于表2-3。

（五）分离纯化菌株转接斜面（斜面接种）

    在分离细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的不同平板上选择分离效果较好的菌落各挑选一个用接种环接种斜面。

表2-3  各类菌株的主要菌落特征和细胞形态

将细菌接种于牛肉膏蛋白胨斜面，放线菌接种于高氏1号斜面，霉菌接种于马丁氏培养基，酵母菌接种于马铃薯葡萄糖斜面上。

    贴好标签，在各自适宜的温度下培养，培养后观察是否为纯种，记录斜面培养条件及菌苔特征于表2-4。置冰箱保藏。

表2-4  四大类微生物斜面培养条件及菌苔特征

五、实验报告

　　1. 简述分离微生物纯种的原则及列出分离操作过程的关键无菌操作技术。

　　2. 将所检测样品中四大类微生物的菌落数填入表2-2。

　　3. 将所检测样品中各类菌株的主要菌落特征和细胞形态填入表2-3。

　　4. 记录斜面培养条件及菌苔特征（包括纯化结果）于表2-4。