一、实验目的

　　1.掌握芽孢染色的方法；

　　2.学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征；

　　3.学习并掌握荚膜染色的基本方法。

二、实验原理

    细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，着色、脱色都比营养细胞困难。芽孢染色法就是根据这一特点设计的：采用一着色力强的染料，并用微火加热，使菌体和芽孢同时着色后再用水洗，使菌体脱色而芽孢仍保留已着的颜色。

细菌的鞭毛极细，其直径通常为10～20nm，只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。其基本原理是在染色前先用媒染剂处理，使媒染剂沉积在鞭毛上，鞭毛直径加粗，然后再进行染色。

    荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖、糖蛋白或多肽，荚膜与染料之间的亲和力弱，不易着色，且可溶于水，易在水洗时被除去。但荚膜的通透性较好，一些染料可透过荚膜而使菌体着色，故常采用负染色法，使菌体和背景着色，荚膜不着色；因而荚膜在菌体周围呈一透明圈。荚膜很薄，含水量又高(90%以上)，故染色时不用热固定，以免荚膜皱缩变形。

三、实验材料

　　1.菌种    根据观察目的的不同，选用不同的实验菌种，见表3-2。

　　2.染料及试剂    孔雀绿染色液，硝酸银鞭毛染色液，黑色素水溶液（见附录Ⅳ），番红溶液，甲醇。

　　3.仪器和用品    显微镜，木夹子，载玻片，酒精灯等。

表3-2  细菌特殊结构观察所选用的菌种

　四、实验方法

　　（一）芽孢的染色

　　1.涂片    取培养24h左右的枯草杆菌，涂片、干燥、固定。

　　2.初染    加3～5滴孔雀绿染色液于已固定的涂片上，用木夹夹住载玻片，用微火加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5min。加热中应随时注意补加染液，切勿使标本干涸。

　　3.水洗    待玻片冷却后倾去染液，水洗至不再褪色为止。

　　4.复染    加番红液1滴，染色1min，水洗。

　　5.镜检    干燥后用油镜观察。

（二）鞭毛染色

　　1.菌种的准备  冰箱保存的菌种要连续移种1～2次，取新配制的营养琼脂斜面接种，28～32℃培养10～14h。

　　2.载玻片的准备  玻片要求光滑，洁净，忌带油迹。将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约20min，取出用清水充分洗净，沥干水后置于95%乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。  

　　3.菌液的制备  取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1～2 mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片。

4.制片  取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温(或37℃温箱)自然干燥。

　　5.染色  涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3～5 min，用蒸馏水充分洗去A液。用B液冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色约数秒至1 min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。

　　6.镜检  干后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色，通常呈波浪形。

（三）荚膜染色

　　1.制片  在载玻片一端加一滴无菌水溶液，取少许培养72h的褐球固氮菌，在水滴中制成菌悬液，取一滴碳素绘图墨水与菌悬液充分混匀。另取一块载玻片作推片，将推片一端平整的边缘与菌液以300角接触后顺势将菌液拉向前方，使其涂成一薄膜，风干。  

　　2.固定  用纯甲醇浸没涂片，固定1min，立即倾去甲醇，文火干燥，勿使玻片发热。

　　3.染色  滴加番红溶液，染色1～2min，细水流适当冲洗，自然干燥。

　　4.镜检  背景黑灰色，荚膜呈一清晰透明圈，菌体红　色。

五、实验报告

　　1.绘图表示枯草芽孢杆菌茵体的形状与芽孢的形状、大小及其着生位置。

　　2.绘图表示有鞭毛细菌的形态特征。

　　3.绘图说明你观察到的细菌的菌体和荚膜的形态。