发酵过程中菌液浓度的检测

摘要：采用分光光度测量发酵菌液浓度，选择波长215nm，首先测定样品中菌液的吸光度，再根据校准曲线获得菌体浓度。该法设备简单。操作方便、快速，测量相对误差小于3％，相对标准偏差小于2%，精密度高，准确度好，适合于生产监控。

关键词：分光光度法；菌液浓度

1 引言

在微生物发酵过程中，为了控制工艺条件，提高产量，需要了解发酵菌的生长规律，及时掌握发酵液的菌体浓度，因此，准确、快速、实时检测发酵液菌体浓度对整个发酵过程有重要的意义。传统测定菌体浓度的方法有稀释平板计数法、重量法、比浊法、血球计数板计数法、电导率法等。其中重量法准确度高，较为常用，但其操作费时、费力，难以满足实时监测的要求；比浊法能快速地判断菌液浓度，但为粗略的估计值，受限于各人肉眼的观察，误差较大，准确性不高 ；其他几种方法工作繁琐，误差较大。分光光度法是利用物质在紫外、可见光区的分子吸收光谱，对物质进行定性、定量分析的方法 。本研究采用分光光度法对大肠杆菌发酵时的菌液浓度进行检测，依据的原理是单位体积菌落数与吸光度的相关性，制成校准曲线，快速准确地测算菌液 浓度，该法简单、准确、快速，适合实际生产中应用。

2 实验部分

2．1 材料与仪器

菌种为大肠杆菌(E．coli)JM109，本实验室保藏；LB培养基(购自美国Sigma公司)，其余试剂均为国产分析纯。

UV一2100型双光束紫外一可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)；YP6000型电子天平(上海精科天平厂)；TGI 一16M 台式高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；pHS23C型酸度计(天津市盛邦科技有限责任公司)。

2．2 吸收波长的确定

取菌液lmL 置于6O℃的水浴中作用20min或煮沸，稀释，取3个稀释度的菌体用UV一21OO型双光束紫外一可见分光光度计在波长200--800nm范围内进行扫描，同时对葡萄球菌也进行光谱扫描，确定最大的吸收波长。

2．3 校准曲线的绘制

准确量取10mI 发酵液，煮沸或60 C的水浴中作用20min，3500r／min离心，收集菌体烘干并称重，即得发酵液菌体的真实浓度。同时取同一发酵液作系列稀释，稀释剂作为空白对照，在最大吸收波长处测量稀释液的吸光度A，由测得标样的吸光度与对应菌体浓度作校准曲线。

2．4 样品的测定

取样品，煮沸或60 C的水浴中作用20min，配制成不同浓度，测吸光度A。在A—C校准曲线上查A的对应浓度C，将C乘以稀释倍数即得样品的菌液浓度。

2．5 准确度实验和精密度实验

以重量法测得的菌体浓度为标准，与本法测得的菌体浓度比较得出其准确度。从发酵罐中取4个不同的样品进行测试，确定其精密度。

3 结果与讨论

3．1 最大吸收波长

经紫外一可见分光光度计扫描后，菌液的吸光度和波长关系曲线可见不同浓度的菌液及不同菌种的吸收峰是相似的，在可见光范围内菌体没有特征性的吸收峰，近似直线，细菌在200-250nm 处显示了较大的吸收峰，其中试验菌在215nm处吸收峰最大，故在测量时选择的波长为215nm 。

3．2 校准曲线

由重量法测定的菌液浓度为基准数据，作系列稀释后测吸光度A，绘制得校准曲线。回归方程为 Y=0．7457x 0．0024，。R2=0．9975，由此可见线性关系良好。在作校准曲线时，要对发酵液热处理杀死细菌，因活菌在发酵液中不稳定，常堆积成团，均匀性差，易造成光度分析的误差。

3．3 准确度试验

不同的发酵时间取5个样品，每个样品平行取5份，每份准确吸取200／H ，稀释后测其吸光度，计算出菌液浓度，取其平均值；同时按重量法测定其真实浓度，计算出相对误差。结果可见，采用本法测量的相对误差均小于3％，该法准确度高，且操作简单、快速。

研究中发现，在发酵过程中菌体浓度较高时，光密度OD与细菌量呈非线性关系，甚至OD值会超出分光光度计读数范围，因此在发酵的后期，要对发酵菌液作稀释才能保持较好的线性关系，提高测量的准确度。另外在测量过程中，要尽量保持相同的实验条件，才能减少误差。

4 结论

分光光度法测量发酵过程中菌体浓度方便、快速、准确，设备要求不高，适合在发酵生产中对菌液浓度进行实时监控。