细菌对消毒剂抗性的研究进展

摘 要：细菌对消毒剂的抗性机制主要包括：细胞膜通透性改变、生物膜形成、主动外排系统、作用靶点改变等。针对消毒剂抗性类型的探讨及其机制的研究对于高效消毒剂的研制与合理应用都具有重要的意义。本文主要针对细菌对市售消毒剂产生抗性的现状以及其抗性机制进行综述。

关键词：细菌；消毒剂；抗性机制

消毒剂的使用已有相当长的历史，正如细菌对抗生素的耐药性一样，长时间接触同一种(类)消毒剂的细菌会对该类消毒剂产生抵抗力，即产生抗性。随着人类社会的发展以及人们健康意识的不断增强，消毒用品的使用越来越广泛，细菌对消毒剂的抗性问题也就越加严重，这已引起人们的广泛关注与重视。

1 细菌对消毒剂抗性的判断

目前人们对消毒剂抗性还没有一个统一的定义。其中最能被人们接受的是Russell等就细菌对消毒剂的抗性判断标准所作的描述，即消毒剂的抗药性是指对消毒剂的常用浓度不再敏感的菌株的出现，也指那些在能杀灭或抑制大部分该种细菌的消毒剂浓度下，不能被杀灭或抑制的菌株的出现，这种现象称为细菌对消毒剂的抗药现象。用于判断某株细菌是否对特定的消毒剂具有抗药性的常用方法有2种：一种是测定该消毒剂对受试菌的最低抑菌浓度(MIC)，另一种是测定其最低杀菌浓度(MBC)，将测定结果与标准株的MIC或MBC作对比来判定受试菌有无耐药性。这2种方法各有优缺点，MIC方法操作简单，耗时短，是目前研究消毒剂抗性的最常用方法。但也有一些学者认为，使用消毒剂的根本目的不仅是抑制细菌生长，更是要杀灭细菌，因而测定MBC更科学合理。当然，无论使用哪一种方法，均应明白一个道理，即“抗性”只是一个相对概念，与消毒剂的使用浓度、作用时间等均有直接关系。

2 细菌对消毒剂的抗性现状

早在1952年，Chaplin等就发现细菌对消毒剂具有一种类似细菌耐药的性质。20世纪60年代陆续发现许多菌株对消毒剂产生了抗性，最早是对季铵盐类(QACs)产生抗性，随之发现对双胍类(如洗必泰)也产生了抗性，近年又发现了对酚类，醇类，碘类等的抗性。常用消毒剂的抗性情况如下。

2.1 金属离子及其盐类

Nakamura等分离出了72株汞抗性假单胞菌，Utsalo发现临床分离的金葡菌比社区人群携带的金葡菌对汞的MIC高得多。

2.2 有机化合物

Hingst等发现，来自污水处理厂排泄水中的细菌分离株(主要有铜绿假单胞菌，恶臭杆菌等)对甲醛的耐受浓度远远大于相应的ATCC标准菌；Kaulfers也注意到了细菌对甲醛的抗药现象。近年来也有细菌对酚类消毒剂抗药的报道，并对其抗性机制进行了初步探索，认为六氯双酚的抗性菌中存在携带有抗性基因的质粒。

2.3 卤类及其化合物

Retyi等研究证实了耐受含氯消毒剂菌株的存在，从小鼠身上分离到对次氯酸钠的MBC比敏感菌高10~32倍的大肠埃希菌。Kearns等报道，3株耐次氯酸的肠球菌能在100 mg/L有效氯中耐受5 min，而敏感菌在0.5 mg/L的有效氯中只需2 min即可被杀灭。碘伏是较为理想的含碘消毒剂，Pyle等报道了经碘化后的假单胞菌重新生长的现象。

2.4 季铵类阳离子表面活性剂

Plotkin等早在1958年就曾报道，40例菌血症可能是由经氯化苯甲烃铵(BZK)浸泡的注射器引起的。Leelaporn等也曾报道，从临床分离了164株凝固酶阴性葡萄球菌，其中64株对十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)有抗性。

3 消毒剂抗性产生的机制

微生物产生对抗生素的耐药性这一特性已经对抗生素的疗效提出了严峻的挑战。细菌的耐药现象早已成为人类医学中最重要的问题之一。消毒剂与抗生素同属于具抑杀微生物作用的化学物质，利用消毒剂进行消毒以杀灭病原体，切断传播途径，已成为预防和控制感染性疾病流行的重要措施。自使用消毒剂以来，人们对微生物采取了“过度的”杀灭和抑制措施，微生物必然也会通过各种机制来抵抗这种作用，导致消毒剂抗性菌株的不断出现。对消毒剂抗性机制的研究可为开发新型、高效、环保的消毒剂提供理论依据，从而可以更加有效地控制疾病传播，促进人类健康事业的发展。在引起消毒剂抗性菌株产生的诸多因素中，起主要作用的有下列3种：⑴医疗卫生措施的选择性压力增加，使耐药微生物得以繁衍；⑵基因发生突变使得耐药菌株产生或耐药谱增大；⑶微生物间的遗传信息传递将耐药基因转移给新宿主。综合起来，细菌对消毒剂的抗性机制可能与生物化学、酶学与遗传学等方面的改变有关。

3.1 非生理性抗性机制

所谓非生理性抗性是指细菌对消毒剂的抗性主要不是由于自身的性质改变所致，而是受周围环境保护而免于消毒剂杀灭的现象。Stickler等建立了通过导尿管用氯已定进行膀胱冲洗的模型，经电子显微镜观察发现，膀胱壁上的细菌被埋在保护性多糖蛋白质复合物中，患者尿沉淀中也发现了埋植在多糖基质中的细菌。由于环境保护使消毒剂不能直接接触细菌，故导致了类似抗性的菌株存在。近年来有报道提示，生物膜形成是细菌对消毒剂产生抗性的重要原因之一。生物膜是微生物被包裹在其自身分泌的多聚物中形成的一种特殊细胞群体结构，其形成过程较为复杂，研究发现该过程受外界环境(如营养成份、pH、温度、渗透压、水流冲刷力、介质的表面特性、铁离子浓度、氧化还原电位等)和菌体自身(如膜表面特性、凝固酶的有无、染色体等)条件的影响。一般来说要经历黏附、发展和成熟3个阶段。生物膜的形成使得消毒剂在作用于细菌时的扩散受限，并与膜产生交互作用，阻碍消毒剂与细菌的接触。此外，膜中细菌的代谢水平也会随之发生改变。

3.2 选择压力的作用

消毒剂的选择压力作用能诱发抗性突变株的产生。有报道指出，消毒剂在食品工业中的使用增加，引起微生物抗性的产生。Langsrud等研究发现，铜绿假单胞菌对苯扎溴铵的抗性能通过诱导产生。只要使用消毒剂，细菌就必然会受到其选择压力的作用，故选择压力在细菌对消毒剂抗性机制中的作用不容忽视。

3.3 通透性屏障

消毒剂的很多作用必须进入细菌胞内才能得到有效发挥，所以通透性屏障是细菌抵抗消毒剂的重要关卡。由于细菌细胞壁或细胞膜通透性的改变，使消毒剂无法到达细胞内的作用靶位而发挥抗菌效能。假单胞菌对氯已定的抗性就与细菌外膜疏水性和超微结构的改变有关。Winder等研究发现，膜蛋白组成的改变导致假单胞菌产生消毒剂抗性。Brozel等采用2,2-亚甲基-双-4-氯酚对假单胞菌进行诱导，成功地获得了对该消毒剂具有抗性的菌株。经膜蛋白分析发现，OprP在抗性菌中的含量降低，揭示OprP在假单胞菌对氯酚消毒剂的抗性形成中起一定作用。膜脂肪酸组成的改变也能引起细菌对消毒剂的抗性。破坏细菌外膜的屏障功能可以显著增加其对消毒剂的敏感性。

3.4 作用位点的改变

消毒剂抗性产生的机制与抗生素耐药机制的最大不同就在于，细菌细胞上消毒剂作用位点的改变对细菌产生抗消毒剂特性的影响不大，因为细菌细胞往往有很多消毒剂作用靶点，某一个靶点的改变通常不足以引起细菌对其产生抗性。

3.5 产生可对抗消毒剂的酶或其他物质

细菌产生降解或抵抗抗生素的酶是其对抗生素耐药的一条重要途径，但有关细菌产生抵抗消毒剂的酶的报道还不多。已有研究显示，某些细菌对甲醛的抗性是由于其产生了能降解甲醛的酶——甲醛脱氢酶，该酶的作用依赖于谷胱甘肽和NAD，由一个1 107 bp的ORF编码，其编码基因位于一个4.6 kb的质粒上。

3.6 质粒介导的消毒剂抗性

近年来，有关金葡菌对消毒剂抗性的研究较为深入，该菌含有多种消毒剂抗性质粒，主要包括编码NAB核酸的结合质粒、pSK1质粒、重金属抗性质粒等。从澳大利亚、北美和欧洲分离的质粒中发现了药物抗性决定因子(qac基因)，不同金葡菌质粒中的qac基因也不同，其中包括多重耐药质粒，含有多种转座子(Tn)，编码对消毒剂(季胺盐类，双胍类，联脒等)的抗性。根据其抗性情况及DNA同源性可将位于金葡菌不同质粒上的消毒剂抗性决定因子分为两大家族：qacA/qacB家族及qacC/qacD家族。qacA/B基因家族编码质子泵依赖性外转蛋白，该蛋白使其他的能量依赖转运物质的同源性更加明显。qacA基因的作用在多重耐药质粒PSK1家族中较为突出，其编码耐受多种无关的疏水性一价阴离子(如溴离子)和二价阳离子(如戊双脒等)的蛋白质。测序分析和疏水性试验表明，QacA含有514个氨基酸残基，约为55 ku；相对氨基酸分析和报告基因-酶试验证实，其属于主动外排蛋白的主要易化超家族DHA14亚类，有14个跨膜α-螺旋，以质子能为驱动力排出底物。有研究表明，QacA的底物为一价和二价的亲脂性阳离子，竞争性试验提示，这些底物结合在QacA蛋白的不同部位。Rouch等证实了qacA基因上游有一个QacR蛋白的编码基因qacR，而QacR是含188个氨基酸残基的多药结合蛋白，属TerR类转录抑制蛋白。无诱导底物时，其结合在qacA启动子下游的假回文序列(IR1)上，抑制qacA的转录。qacR基因过度表达则会阻止qacA的表达，这表明qacR是qacA的转录抑制子。qacB的表达只与细菌对一价阳离子的抗性有关，这是因为QacA的第323个氨基酸是天冬氨酸，而QacB的相应位置上却是非极性的丙氨酸。当QacB突变株的第322位为酸性氨基酸时，就表现出对二价阳离子的耐药。QacA和QacB都含有14-Tms，而322和323位的氨基酸位于Tms-10上，这2个氨基酸决定着这2个蛋白质与二价阳离子的正电荷基团相结合并进行转运的能力，也可能通过变构直接影响其他位点的结合。qacC和qacD基因编码相同的表型并且显示严格的位点同源性。qacC基因可能由qacD基因进化而来。此外，王春新等从铜绿假单胞菌检出了qacE△1基因，为我国的首次发现。大量研究揭示，主动外排机制在细菌对消毒

剂产生抗性中起着重要作用。其中研究最清楚的是细菌对季铵盐类(QACs)的抗性，很多种类的外排系统均参与其中。革兰阳性菌中的绝大多数外排系统由质粒编码。在金葡菌中也已发现了很多外排系统。细菌的主动外排系统可以分为5大类：即小多重药物抗性家族(smallmulti-drug resistance, SMR)、主要易化子超家族(majorfacilitator superfamily, MFS)、ATP结合盒家族(ATPbinding cassette, ABC)、耐药瘤细胞分裂家族(resistancenodulation cell division, RND)和多重药物及毒物外排家族(multi-drug and toxic compound extrusion, MATE)。其中，MFS中与细菌消毒剂抗性相关的主动外排蛋白包括2类：14-Tms和12-Tms转运子。MFS有许多高度保守的氨基酸多肽序列，这些多肽序列在转运子的结构或功能上发挥着重要作用。

4 结语

细菌对消毒剂抗性的产生引起医院感染的流行和传播，而且对食品工业也造成重大危害，给人类健康和社会经济带来重大影响。目前普遍认为，消毒剂的滥用，使用剂量不规范，处理方法不当，是消毒剂抗性产生的主要原因。因此，在应用消毒剂时，以大剂量一次性杀菌为宜。此外，细菌在长时间脱离接触某消毒剂后，对该药的抗性可能会消失，故最好几种消毒剂交替使用。对消毒剂抗性机制的深入研究，对于探讨高效低毒消毒剂的研制与合理应用，消除细菌对消毒剂产生抗性的问题有十分重要的意义。