核酸染料是凝胶检测相关试验的重要试剂，对于分子生物学相关专业的同学来说并不陌生。虽然在试验中经常会用到，但对于核酸染料的特性、适用范围、稳定性以及性价比等，你又了解多少呢？本期就和小编一起了解下常用的核酸染料都有哪些不能不说的“秘密”吧。

常见核酸染料的种类

国内市场以EB、SYBR、GoldView和GelRed这几种类型的核酸染料为主，下面来分别介绍一下。

1.Ethidium Bromide（EB，溴化乙锭）

EB是应用较早的核酸着色物质，本身在紫外照射下不发光（或发光很微弱），但它能与单链或双链DNA高效结合，结合后的复合物在紫外照射下（300 nm左右）会发出明亮的橙红色荧光，从而便于观察。因其便宜、灵敏度高且操作方便等特点，一直作为琼脂糖核酸电泳最常用的荧光染料。

但随着人们对EB特性认识的深入，了解到EB具有非常明显的毒性及诱导遗传物质（DNA）突变（致癌）的特性，导致现在很多人对其敬而远之，后续也就随之出现了多种以安全性为主打的无毒/低毒的核酸染料，俗称EB替代染料。

2.SYBR系染料

SYBR系列以Invitrogen品牌（现属于ThermoFisher旗下）最为出名，SYBR系核酸染料自推出以来，因其灵敏度和安全性而大受欢迎，成为该品牌的明星产品之一。耳熟能详的SYBR Green I 荧光染料，就是最早应用于核酸检测方面的EB替代染料。

不同种类的SYBR系核酸染料有不同的特点，如SYBR Green I 主要结合DNA，而SYBR Green II 主要结合RNA；SYBR Gold在灵敏度上有明显的优势；而SYBR Safe在安全性上则更胜一筹。

3.GelRed系染料

GelRed系染料主要是指GelRed和GelGreen，也是EB的替代核酸染料，其检测灵敏度不低于EB。相关资料显示，在GelRed胶染色工作浓度的18.5倍的情况下，GelRed和GelGreen都没有表现出毒性和诱变性^【1】；GelRed 和GelGreen 的特殊化学结构^【2】使其难以穿透细胞膜进入细胞，从而降低了该系染料的细胞毒性。

4.GoldView系染料

GoldView系染料是在国内市场比较流行的一类染料，由于产品宣称低毒，且价格相对便宜，受到了国内一部分老师和同学的青睐。由于该系染料争议较多，关于具体的安全性，小编在这里就不多做介绍了，感兴趣的同学可以自行搜索。

核酸染料的评价

这么多种类型的染料，我们应该用哪些指标去评价它们，以找到适合的染料呢？

小编认为，可以从安全性、灵敏度、稳定性、对染色效果的影响（比如染色方法、迁移率等）以及价格等方面来对染料进行评价。

01 安全性

既然选择了EB替代染料，那么染料的安全性就是一个非常重要的指标。

安全性评估主要的检测有Ames测试、细胞渗透性实验、染色体畸变和正向突变分析、口服毒性分析等。在安全性方面，具有较多检测项目和相对权威的机构出具检测报告的核酸染料，安全性可能会更高；另外在一些报道或对比数据中，我们也可根据它们可能的原料来判断它们的安全性^【3】。

02灵敏度

几乎所有的EB替代染料都宣称其染料的灵敏度至少不低于EB，甚至高于EB，具体到试验内容上，只要不是有特殊的需求（需要极高的灵敏度），一般都能满足。

03稳定性

核酸染料的稳定性和在各种条件下的染色效果，会直接影响观察到的染色结果。比如，Invitrogen的专家发现pH会明显影响SYBR系染色效率，如果它高于8.3或低于7.5，它的检测灵敏度显著下降。这种情况很容易被忽视，就如常见的Tris缓冲液的pH值会随着温度的变化而变化。

04迁移率

在介绍迁移率之前，先了解下常用的核酸染料电泳中应用的3种方式。

（1）点染法：

是指将核酸染料、样品和上样缓冲液混在一起，直接在胶上点样；

（2）胶染法：

是指在将融胶倒入胶板前，把核酸染料加入融化的琼脂糖凝胶溶液中混匀，然后再倒入胶板，这种方法也是最常用的方法；

（3）泡染法：

是指在电泳时不加入任何染料，在电泳完成后，将胶置入含有一定浓度核酸染料的染液中进行染色。

从图1的结果（以全式金公司的GelStain为例），可以看出，泡染法，条带效果最好；点染法，不同浓度的GelStain条带效果不一致，迁移率也不一致，容易造成较大误差；胶染法，介于两者之间。

图1 不同的染色方法对于核酸电泳的影响

Lane 1: Trans2K^® plus DNA Marker(5 μl)

Lane 2: Trans2K^® plus II DNA Marker(5 μl)

表1 不同的染色方法费用核算（元）

注：以5 μl 上样量计算，1000×: 0.005 μl 0.00486元。按照每80 ml 50个样品计算，价格按照5×1 ml规格计算。

由于所有的核酸染料最终都会结合到DNA上，才能通过染料从而对DNA进行分析，这也就意味着如果采用点染法或胶染法进行核酸检测时，根据使用的染料不同，核酸染料或多或少会对核酸的迁移率甚至带型产生影响。一般来说，核酸染料分子越大，安全性会越高；但同时，用胶染法对电泳的迁移率或带型影响就越明显，虽然可以通过减少核酸上样量等方式来进行改善，但仍达不到泡染法的效果。这也是为什么大多数核酸染料（低毒/无毒）厂商建议，采用泡染法来得到准确、漂亮的核酸带型。

当然，对带型、迁移率等的影响除了核酸染料外，还有其它的影响因素，比如琼脂糖的质量，电泳缓冲液的缓冲能力等都有可能对带型和迁移率产生影响。

看到这里，有的同学可能会有疑问，如果想从EB换为低毒/无毒的核酸染料，以前被EB污染的区域怎么办呢？如何处理才能放心更换呢？别着急，贴心的小编已经为你准备好相应的资料了，具体的方法请看下面的附录一吧。

介绍了这么多，最后，小编给大家正式介绍一下全式金公司的核酸染料金品。

GelStain金品介绍

GelStain是一种灵敏、稳定和相对安全的荧光核酸染色试剂。它可以替代高毒性染色剂-溴化乙锭(EB)，用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中dsDNA、ssDNA和RNA的染色。GelStain的灵敏度远高于EB，并且不需要脱色。

01 特点

无毒性：GelStain独特的油性和大分子特点使其不能穿透细胞膜进入细胞内，艾姆斯氏实验结果也表明，该染料的诱变性远远小于EB。

灵敏度高：适用于不同大小的片段电泳染色，对核酸迁移率的影响小于SYBR Green I。

稳定性高：适用于使用微波或其它加热方法制备琼脂糖凝胶；室温下在酸性、碱性环境下极其稳定，耐光性强。

信噪比高：样品荧光信号强，背景信号低。

操作简单：与EB一样，在预制胶和电泳过程中染料不降解；而电泳后染色过程也只需30分钟且无需脱色或冲洗，即可直接用紫外凝胶透射仪观察。

适用范围广：可选择电泳前染色（胶染法）或电泳后染色(泡染法)；适用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳；可用于dsDNA、ssDNA或RNA染色。

无需改变滤光片及观察装置：标准的EB滤光片或SYBR滤光片都适用，使用与观察EB染色相同的普通紫外凝胶透射仪观察即可，在300 nm紫外光附近可得到最佳激发。

具体的使用方法可参看附录二中的内容哦。

02 GelStain无毒检测

附录一

Decontamination of Equipment Contaminated With Ethidium Bromide^【4】

Wash the equipment once with a paper towel soaked in a decontamination solution consisting of 4.2 g of sodium nitrite and 20mL of hypophosphorous acid (50%) in 300mL of H2O. Then wash five times with wet paper towels using a fresh towel each time. Soak all the towels in decontamination solution for 1 h, check for completeness of decontamination, and discard it. Make up the decontamination solution just prior to use.

Glass, stainless steel, Formica, floor tile, and the filters of transilluminators have been successfully decontaminated using this technique^【5】. No change in the optical properties of the transilluminator filter could be detected even after a number of decontamination cycles using the decontamination solution.

If the decontamination solution (pH 1.8) is felt to be too corrosive for the surface to be decontaminated, then use six H2O washes. Again, soak all towels in decontamination solution for 1 h before disposal.

附录二

GelStain使用方法推荐 ——

方法一：胶染法，用法同EB

制胶时加入GelStain 核酸染料，使其工作浓度为1×（每10 ml 琼脂糖溶液中加入1 ml GelStain储液，以此比例类推）。

注意事项：

（1）由于GelStain具有良好的热稳定性，可以在热的琼脂糖溶液中直接添加，而不需要等待溶液冷却，摇晃混匀。也可以选择将它们的储液加到琼脂糖粉末和电泳缓冲液中，然后用微波炉加热以制备琼脂糖凝胶。GelStain兼容所有常用的电泳缓冲液。

（2）此方法不适合预制聚丙烯酰胺凝胶，对于聚丙烯酰胺凝胶请使用泡染法。

方法二：泡染法

将GelStain 10000×储液用0.1 M NaCl稀释约3300倍，制成3×染色液。（例如：将15 μl GelStain 10000×储液和5 ml 1 M NaCl加入到45 ml H2O中）。将凝胶小心地放入合适的容器中，如聚丙烯容器中。缓慢加入足量的3×染色液浸没凝胶，室温震荡染色30分钟左右，最佳染色时间根据凝胶厚度以及琼脂糖浓度不同而略有不同。对于3.5-10%丙烯酰胺的凝胶，染色时间通常介于30分钟到1小时，并随丙烯酰胺浓度增加而延长。

注意事项：

（1）用泡染法染色时，染料用量较多。3×GelStain染色液可重复使用3次左右。

（2）3×GelStain染色液可以大量制备，在室温下避光保存直至用完。

参考内容

【1】A summary of mutagenicity and environmental safety test results from three independent laboratories for the nucleic acid gel stains GelRed® and GelGreen®. www.biotium.com.

【2】F. A. P. Crisafuli E. B. Ramos M. S. Rocha. Characterizing the interaction between DNA and GelRed fluorescent stain. EBSA.

【3】Mikhail Guzaev, Xue Li, Candice Park, Wai-Yee Leung, and Lori Roberts. Comparison of Nucleic Acid Gel Stains Cell permeability, safety, and sensitivity of ethidium bromide alternatives. Biotium, Inc., Fremont, CA

【4】George Lunn &Eric B. Sansone. Destruction of hazardous chemicals in the laboratory (Third Eidition).

【5】Lunn, G.; Sansone, E.B. Decontamination of ethidium bromide spills. Appl. Ind. Hyg.