1960年，电子和氢离子传递过程中的磷酸化耦合机制被阐明后，线粒体作为ATP的生产场所被人们所熟知。30年后，线粒体以调节、执行细胞凋亡的新身份，再次受到广大研究者的高度关注，并逐渐成为凋亡通路中心的重要细胞器。它能够传递和放大死亡信号，是凋亡上游途径和Caspase途径以及其他下游死亡途径互相作用的中心环节。

线粒体由双层膜包围而成：外膜通过VDAC的介导，相较于内膜，对高至5000 Da的分子具有更强的通透性，但对膜间隙的促凋亡蛋白却不具有通透性；内膜包裹线粒体基质，呈嵴状折叠，在电化学梯度的驱动下，通过载体蛋白运输小分子。

图1 线粒体结构

研究表明，目前线粒体介导凋亡的途径主要有3种：

（1）破坏细胞抗氧化的能力；

（2）破坏电子传递链，扰乱氧化磷酸化过程，阻碍ATP的产生；

（3）细胞凋亡的线粒体通路。下面主要介绍第3种途径。

一、 Bcl-2家族蛋白参与线粒体凋亡通路

Bcl-2家族蛋白根据其结构和功能的不同，可分为3个亚家族：

（1）抑凋亡蛋白，Bcl-2、Bcl-xL等；

（2）促凋亡蛋白，包含BH123结构域，成员有Bax、Bak等；

（3）促凋亡蛋白，仅含BH3结构域，成员包括Bad、Bid、Bim等（如图2所示）。

图2 Bcl-2家族蛋白。BH：Bcl同源结构域；TM：跨膜域

正常情况下，Bcl-2、Bcl-xL与Bax、Bak形成异源二聚体，维持线粒体外膜的完整性，阻止线粒体凋亡反应。在凋亡信号刺激下，Bax和BH3蛋白的表达量增多，并与Bcl-2、Bcl-xL相结合，释放Bax/Bak，自由的Bax和Bak形成低聚物，释放Cyt C。

图3 Bcl-2家族蛋白的定位与功能。抑凋亡成员存在于线粒体外膜，促凋亡成员可在胞液并且可转移至线粒体膜。

二、 线粒体膜的变化

Cyt C释放孔道是如何形成的呢？

它与Bcl-2家族蛋白的作用和线粒体膜的变化密不可分。

Bcl-2、Bcl-xL、Bax等能够插入线粒体膜中，形成离子通道，改变膜的通透性。Shimizu等发现Bax可以通过与线粒体外膜的VDAC结合发挥作用，更有研究者在脂质体重建VDAC-ANT孔道研究中，发现Bax蛋白是孔道保持活性的必需组成。

另外，Bcl-2家族蛋白还可与其他孔蛋白相互作用，诱导线粒体通透性转变孔道开放，使胞浆和线粒体基质内的离子动态流动，例如：大量Ca²⁺流入胞质中，造成高渗状态，从而释放Cyt C。

与此同时，以上两种途径均可引起线粒体膜电位降低，膜电位的降低是细胞凋亡的特征性标志。另外，线粒体膜通透性的改变也会使呼吸链与氧化磷酸化失偶联，终止ATP的合成，最终导致细胞走向凋亡。

三、 Cyt C参与线粒体凋亡通路

自1990年Bcl-2蛋白在线粒体膜中被发现，便开启了线粒体调节和执行哺乳动物细胞凋亡的研究大门。在接下来的几年间，多种激活凋亡的线粒体蛋白被陆续发现和证实，这些蛋白通常存在于线粒体膜间隙，受到凋亡促进因子刺激后，释放到胞质中，介导凋亡的执行。

Cyt C作为载体，能够在线粒体呼吸链中传递电子，建立线粒体的跨膜电位，并产生ATP。当Cyt C缺失或者功能障碍，会使呼吸链功能异常，ATP生成受阻，导致细胞凋亡。

当受到促凋亡蛋白诱导后，Cyt C从线粒体膜间隙释放到胞质中，与Apaf-1结合，激活Apaf-1的核苷酸交换活性，此时ADP/dADP关联的非活性Apaf-1变为与ATP/dATP结合的活性Apaf-1，并形成轮状复合体，继而募集Caspase 9酶原，形成凋亡体，并启动下游Caspase级联反应。

图4 Cyt C的释放。Cyt C从膜间隙释放，形成凋亡体，启动Caspases

参与线粒体介导的促凋亡蛋白除了Cyt C，还有AIF、SMAC、Omi/HtrA₂、Endo G等，在凋亡期间，这些蛋白也是从线粒体膜间隙释放至胞液。其中，SMAC、Omi/HtrA₂可结合IAPs，对抗IAPs对Caspase 3、9的抑制，属于Caspase依赖型蛋白；AIF、Endo G可转位至细胞核，使染色质凝缩、大规模DNA片段化，属于非Caspase依赖型蛋白。

                                四、 Caspase参与线粒体凋亡通路

Caspases分布于胞质内，是具有相似结构的半胱氨酸蛋白酶系，在参与介导细胞凋亡中起着重要的作用。正常状态下，Caspases都维持着不具有功能活性的酶原状态，受到凋亡诱导因子刺激时，酶原被激活成活性Caspase，执行凋亡。

目前，研究显示与线粒体关系最为密切的是Caspase 3和Caspase 9。并且普遍认为主要有2种途径活化Caspase 3和Caspase 9：

 Cyt C从线粒体释放至胞质，与Apaf-1、Caspase 9酶原结合形成凋亡体，活化Caspase 3。

 线粒体跨膜电位下降时，不仅仅释放Cyt C，也会释放凋亡诱导因子AIF，AIF在胞质中能够直接激活Caspase 3，继而活化Caspase 9。

                              五、 线粒体通路介导的细胞凋亡相关疾病

异常凋亡性细胞死亡是肿瘤发生和进展的标志之一，癌细胞利用多种机制来解除线粒体通路的正常运行，导致凋亡受阻，进而获得自身生存优势。

那么，对线粒体通路进行靶向作用，成为治疗癌症的途径之一。目前，大量的药物研究致力于靶向作用Bcl-2家族成员，其中第一个临床试验制剂—奥利默森钠（oblimersen sodium），可结合人类bcl-2 mRNA，使其降解。其他靶向思路也包括开发BH3类似化合物，恢复突变体p53的活性，阻止IAP蛋白活性（如：SMAC类似物），开发Caspase 3激活试剂（如：经高通量筛选出的PETCM、GA、MX-206）等（如图5）。且越来越多的研究表明，联合疗法能达到更好的治疗效果。

六、 线粒体的分离

既然线粒体的作用如此重要，我们对它的研究自然是必不可少的。在进行众多凋亡实验中，对线粒体的分离是十分基础和重要的步骤。

全式金自主研发的两款线粒体分离试剂盒：ProteinExt^® Mammalian Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells和ProteinExt^® Mammalian Mitochondria Isolation Kit for Tissue，提供了两种方法（试剂法和匀浆法）用于高效、快速地从哺乳动物细胞或组织样品中分离线粒体。同匀浆法相比，试剂法的提取过程更温和，可以最大限度地降低对线粒体的损害，并且可以同时处理多个样品。

流程：收集细胞或研磨组织→裂解细胞浆膜→去除细胞碎片→收集线粒体→润洗线粒体。

 产品具有以下优势：

提供的试剂法线粒体提取方法非常温和、无需进行匀浆，可以最大限度地降低对线粒体的损害；

提取的线粒体量高，与Pierce持平（见图产品优势1）；

试剂法可以同时处理多个样品（匀浆法每次只能处理一个样品）。

分离出的线粒体完整性良好，可用于蛋白检测、细胞凋亡、信号转导及代谢研究等实验（见图产品优势2）；

本试剂盒具有分离效果好、操作简便、快速等优点。

需要注意的是：

MIBI、MIBIII和MSB使用前需加入ProteinSafe^TM Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free（100x），使其工作浓度为1x。

所有操作均需在冰上或2-8 进行。

采用匀浆法时，需自备1-2 ml玻璃匀浆器，匀浆次数随细胞和细胞数不同而不同。

如需进行下游功能检测，则要使用新鲜的细胞样品或组织样品进行线粒体提取。

对线粒体的研究，有助于细胞凋亡通路的深入探索，应用于临床，则体现在疾病的治疗、靶向药物的研发等领域，所以具有十分重要的意义和价值。

[1] Xiong, S.B., et al., 2014. Mitochondria-mediated apoptosis in mammals. Protein & Cell, 5(10), 737-749.

[2] Mohamad, N., et al., 2005. Mitochondrial apoptotic pathways. Biocell, 29(2), 149-161.

[3] 陈国元，王为，张振. 线粒体在细胞凋亡中的作用的研究进展. 国外医学（医学地理分册），2014，35（2）：85-88.

[4] 王佺荃，张文丽，元小冬，彭伟，骆泓洁. 线粒体在细胞凋亡中的作用. 中国医学创新，2015，12（6）：143-146.

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