根据之前的内容可以了解到：一般来讲，凋亡早期，主要涉及胞内一些蛋白的变化，例如蛋白量的增高、位置的迁移、状态的改变等，还有一些磷脂、Ca²⁺的变化等；中晚期则伴随着DNA的断裂、凋亡小体的形成；而细胞形态的改变则伴随着整个凋亡过程。

因此，根据这些特点，下面我们主要来介绍早期凋亡相应的检测方法：

                                              01 流式细胞术         

流式细胞术是生命科学研究中的常用技术，也是细胞凋亡检测的重要手段之一。其基本原理是细胞通过流式细胞仪激光焦点时可以发生光散射，利用产生的前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC），可以检测细胞大小、形态和结构的变化，进而对凋亡细胞、坏死细胞、正常细胞进行分析。

目前可以采用单染色法和双染色法对细胞进行染色，其中Annexin V/PI法是当下较为流行的检测细胞凋亡的方法。TransDetect^® Annexin V-FITC/PI Cell Apoptosis Detection Kit（FA101）利用Annexin V是检测早期细胞凋亡最灵敏指标之一的特点，对外翻的磷脂酰丝氨酸(PS)进行结合，然后以标记了绿色荧光的Annexin V作为探针，用流式细胞仪（也可用荧光显微镜）进行检测；同时碘化丙啶(PI)作为一种核酸染料，不能透过具备完整细胞膜的正常细胞和早期凋亡细胞，但能够透过凋亡中晚期的细胞和坏死细胞的细胞膜而将细胞核染色，在特定激发光条件下呈现红色，匹配Annexin V使用，将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

图1 用10 μM Camptothecin诱导Jurkat T淋巴瘤细胞4小时，细胞发生凋亡后进行流式细胞仪检测：左下象限 (Annexin V-/PI-) 代表活细胞；右下象限(Annexin V+ /PI-) 代表早期凋亡细胞；右上象限(Annexin V+ /PI+)代表凋亡晚期细胞和坏死细胞；左上象限(Annexin V-/PI+) 被认为是许可范围内的检测误差。

流式细胞技术检测细胞凋亡既可以定性又可以定量，TransDetect^® Annexin V-EGFP/PI Cell Apoptosis Detection Kit（FA111）与FITC相比，EGFP更加稳定、荧光更强且不易猝灭，并且由于Annexin V-EGFP是融合蛋白，EGFP与PS的结合比例为1:1，因此可以进行定量检测。

两款产品均具有操作简单、快速、敏感等众多优点，但检验样品前需要获得单细胞悬液才能更好得进行检测，获好更好的实验结果。

                                                02抗体检测法           

1. Bax的定位检测

Bax（Bcl-2-associated X protein）是Bcl-2蛋白家族成员之一，其能和同家族蛋白以二聚体的形式促进细胞凋亡。在细胞未受到凋亡信号刺激时，该蛋白定位于胞浆。早期凋亡时期，Bax经构象改变形成异二聚体从胞浆转运至线粒体外膜，使线粒体电压依赖性阴离子通道（VDAC）打开，改变膜电位，释放各种促凋亡因子，ProteinFind^® Anti-Bax Mouse Monoclonal Antibody（HA101）采用Bax定位原理，能对其进行荧光标记和检测。

图2 检测HeLa细胞内源性Bax的定位（绿色）。结果显示，细胞免疫荧光结果为阳性，特异性良好。

2. Cyt C的定位检测

Cyt C是一种电子传递蛋白，定位于线粒体膜间隙。当细胞受到凋亡刺激之后，Cyt C从线粒体释放至胞浆，ProteinFind^® Anti-Cytochrome C Mouse Monoclonal Antibody（HA103）可用于结合标记Cyt C；同时，线粒体内膜上的Cyt C氧化酶亚单位IV(COX4)作为线粒体富集的标志保留在线粒体内，ProteinFind^® Anti-COX IV Mouse Monoclonal Antibody（HL101）可以结合标记COX IV。

从凋亡细胞和非凋亡细胞中分离出富集的线粒体，用Cyt C抗体和COX4抗体可显示Cyt C和COX4的位置, 从而检测凋亡细胞的发生。

图3 左图是检测HeLa细胞内源性Cyt C定位（绿色），右图是检测HeLa细胞中内源性COX IV定位（绿色），结果显示特异性良好。

3.  Caspase和PARP的活性检测

正常状态下，Caspase-9以非活性的酶原形式存在于细胞中，当细胞受到凋亡信号刺激后，Apaf-1与Procaspase-9结合，使得Procaspase-9被剪切而发生活化，活化的Caspase-9使Caspase-3发生剪切，启动Caspase级联激活。ProteinFind^® Anti-Caspase 9 Mouse Monoclonal Antibody（HA102）可作用并标记Caspase-9，用于早期凋亡检测。

图4 检测HeLa细胞内源性Caspase-9的定位，免疫荧光为阳性，Caspase-9主要定位于细胞质（绿色），特异性强。

Caspase-3是凋亡通路下游的水解酶，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。正常细胞中Caspase-3以酶原形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，活化的Caspase-3由两个大小亚基组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。因此，Caspase-3常被作为细胞凋亡的早期检测指标。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，Caspase-3的活性明显下降，无法直接区分凋亡与坏死细胞。

聚多聚酶（PARP）是一种Zn²⁺依赖性的真核DNA结合蛋白，可特异性地识别DNA断裂末端并结合，是一种重要的DNA修复酶。在凋亡早期，Caspase-3作用于PARP，使其裂解为89 kD和24 kD 2个片段，修复作用丧失。其中89 kD片段产生后会游出细胞核，因而89 kD可以作为细胞发生凋亡检测的一个指标，可以用ProteinFind^®Anti-PARP Mouse Monoclonal Antibody（HA107）通过蛋白印迹法检测PARP的89 kD片段。

图5 左图是WB：检测HeLa细胞中PARP蛋白的表达；右图是对人乳腺癌组织的IHC检测，免疫组化阳性率高，特异性强。

以上5款用于蛋白检测的特异性抗体产品均用途广泛，根据不同抗体的具体使用场景可分别用于western 检测、免疫共沉淀检测、免疫荧光检测、流式细胞术检测、以及免疫组化检测，并且具有高灵敏度、高特异性等优势，建议大家在做相关实验时根据说明书选择使用。

以上为早期凋亡检测（上）的全部内容，希望对大家有所帮助，下期将为您介绍更多早期凋亡的检测方法，祝您科研顺利。

参考文献

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[4] Martin Renatus, Henning R. Stennicke, Fiona L. Scott, Robert C. Liddington, and Guy S. Salvesen. Dimer formation drives the activation of the cell death protease caspase 9. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Dec 4; 98 (25): 14250-5.

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