利用干细胞技术可替代、修复、重建或再生人体各组织器官。将处于不同发育时期的胚胎细胞进行体外培养就可以建立研究体内发育的体外细胞模型。将人囊胚期胚胎进行体外培养可以建立人胚胎干细胞系。

今天我们要分享的是，培养多能干细胞的实验方法。

多能干细胞（Pluripotent Stem Cell）是一类具有无限自我更新能力，同时维持多种细胞分化潜能的细胞。在一定条件下，多能干细胞具有分化出几乎所有细胞组织的潜能。因此，多能干细胞是当前干细胞研究的热点和焦点。多能干细胞的研究不仅具有重要的理论意义，而且在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。

液体配置及前处理准备

Accutase：4摄氏度解冻，分装后保存于-20摄氏度；

TransStem^TM Chemically Defined Xeno-free Human Pluripotent Stem Cell Medium ：4摄氏度解冻添加物，使用时吸取1 ml添加物添加到99 ml基础培养液中充分混合；

Y-27632 (5 mM)：室温6.25 ml PBS或ddH2O溶解10 mg Y-27632，可分装10 μl每管，-20摄氏度保存；

Matrigel：于4摄氏度过夜解冻后，冰上分装0.5 ml每管，保存于-20摄氏度，避免反复冻融。操作时，必须使用预冷的枪头；

Vitronectin：Matrigel的成分确定替代物，4摄氏度过夜解冻后，于冰上分装，保存于-20摄氏度，同Matrigel；

注：与hPSC相关的所有液体，包括培养维持、冻存、分化，均要避免37摄氏度水浴，从4摄氏度取出自然恢复到室温即可开始实验。

铺皿

通常来说按照1:60到1:100之间的比例使用冷的DMEM/F-12稀释Matrigel即可达到很好的效果。

按照6孔板每孔1 ml、12孔板每孔0.5 ml的体积计算好需要的液体体积，从冰箱取出冷的DMEM/F-12并吸出需要的体积备用，立即从冰箱取出预冷枪头和Matrigel原液，按照需要的比例使用冷枪头迅速在DMEM/F-12中加入Matrigel，立即混匀，（操作迅速的话无需在冰上进行）将枪头和Matrigel放回4摄氏度冰箱。

将混合的液体加入到孔板内（无需冷枪头），摇晃混匀，使孔板皿底全部被覆盖，置于37摄氏度进行包被，或封口膜封闭后保存于4摄氏度备用（可保存一周）。

37摄氏度包被可在4小时后使用，一般不超过24小时，否则皿底易出现凝胶块，hPSC会向三维生长。

多能性干细胞维持

多能性干细胞联会度低于20%时可以隔天换液；

联会度在20~50%时需要每天换液，可12孔板每孔0.9 ml E8， 6孔板每孔1.8 ml E8；

联会度在50 ~ 80%时需要每天换液，可12孔板每孔1 ml E8， 6孔板每孔2 ml E8；

联会度达到80%时可以进行传代、冻存或多能性集落筛选。

多能性干细胞传代

1. 干细胞培养需每天早晚观察，一旦发现有需要传代的细胞即准备Matrigel包被孔板，于下午或次日早上进行传代；

2. （可选）从培养箱取出包被好的孔板放在超净台内进行室温平衡，进行下面操作；

3. 吸弃待传代细胞孔内的培养液，加入约0.5 ml DMEM/F-12清洗死细胞等杂质，吸弃DMEM/F-12，加入1 ml Accutase，置于37摄氏度进行孵育，4~5分钟；

4. 等待时，准备传代重悬的培养液：吸取需要体积的E8培养液（6孔板，1 ml每孔；12孔板，0.5 ml每孔），并向其中加入适量Y-27632混匀；

5. 取消化好的孔板，向其中加入与Accutase等体积的DMEM/F-12液体终止，吹打不多于3次转移到离心管内，若发现皿底仍有大量集落贴附，可再加入1 ml DMEM/F-12并用1 ml枪头刮擦，收集1 ml DMEM/F-12，800 rpm离心3分钟；

6. 弃上清，使用第4步中准备的液体重悬，吹打不多于3次；

7. 吸弃铺皿孔板内的液体（DMEM/F-12 + Matrigel），按照6孔板每孔1 ml，12孔板每孔0.5 ml的体积加入细胞悬液；

8. 约8~12小时后（上午传代，下午下班前；下午传代则过夜）观察细胞状态，更换无ROCKi的培养液，体积按照联会度自行判断（此时hPSC会有些许形变，主要呈现更加明显的细胞极性，撤掉ROCKi后会自行恢复）。

多能性干细胞筛选

1. 在hPSC联会度处于50 ~ 80%时可以使用ReLeSR进行多能性集落筛选，原理是倾向于分化或已经分化的集落的基质不能被ReLeSR酶解脱壁；

2. 准备室温保存的ReLeSR，由4摄氏度恢复到室温的DMEM/F-12和E8培养液，提前用Matrigel包被好的孔板；

3. 吸弃待筛选的hPSC孔内的培养液，加入适量体积的DMEM/F-12清洗一次，加入1 ml ReLeSR，室温静置计时约50秒，吸弃大部分ReLeSR，此处应保留极少量的ReLeSR液体在孔内，使得其平放时可以在细胞表面形成一层液膜；

4. 将上述孔板置于37摄氏度培养箱内静置5 ~ 8分钟（对不同条件下培养的不同hPSC来说，有不同的最适孵育时间，第一次筛选需要做梯度实验确定，一般来说5分钟即可）；

5. 将上述孔板取出，加入1 ml E8培养液，左手持孔板一侧，右侧持续拍打孔板另一侧约1分钟（效果理想的话，拍打几下即可见到hPSC集落脱离孔板底部），收集脱离的hPSC集落，不要吹打；

6. 吸弃铺皿孔板中的液体，加入E8培养液，按照适宜的比例直接加入第5步中脱离皿底的干细胞集落（不需ROCKi），摇匀后放入培养箱培养。

多能性干细胞冻存与复苏

1. 同传代步骤或筛选步骤获得离心后的hPSC细胞沉淀；

2. 按照1 ml每冻存管的量加入TransStemTM Chemically Defined Xeno-free Cell Cryopreservation Medium重悬，分装到各个冻存管内，梯度降温至-80摄氏度，过夜后转移到液氮（使用专业的冻存盒，4摄氏度20分钟，-20摄氏度2小时的冻存策略会大大减低复苏效率）；

3. 复苏时在37摄氏度水浴锅迅速解冻细胞，将1 ml含hPSC的悬液加入到5 ml的DMEM/F-12（或E8培养液）中，800 rpm离心3分钟；

4. 同传代步骤进行接种，需要添加ROCKi抑制凋亡。

全式金研发部 佟曼  ▏文