Western Blot技术——蛋白质印迹法，又称免疫印迹实验，它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。基本原理是通过特异性的抗体对凝胶电泳处理过的细胞或组织样品进行着色，通过着色的位置和着色的深浅获得特定蛋白在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

1979年，G.R.Stark在PNAS发表的文章中提出了一种新的检测蛋白的方法：取细胞的蛋白，在电场作用下将蛋白转移到滤膜上，之后使用目的蛋白的抗血清孵育滤膜，再使用放射性同位素标记的第二抗体进行孵育，最终通过放射自显影技术使条带显示在膜上，这就是Western Blot技术。

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图1 最早的Western Blot结果

图片来源：Renart, J., J. Reiser, G. R. Stark, (1979).

此技术可用于定性或者半定量地分析目的蛋白的特异性表达；蛋白-蛋白、蛋白-DNA、蛋白-RNA相互作用的后续分析；也可用于分析蛋白翻译后修饰，如磷酸化、糖基化、羟基化等；还可用于蛋白的组织定位分析。

根据检测原理可将Western Blot分为直接法和间接法：直接法即目的抗体上直接标记检测基团，通过抗体与目的蛋白的结合检测其表达情况；间接法通过带有检测基团的第二抗体即抗体的抗体，进行检测，二抗的级联放大作用可以检测到微量蛋白的表达。

Western Blot主要包括以下几个步骤：

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图2 Western Blot实验流程

下面对这些步骤进行一一介绍。

一、 样品制备

要选择耗时短，易于操作的提取方法。整个操作过程要在低温下进行，以保证蛋白处于溶解状态，防止蛋白变性、降解与修饰。制备好的样品如果不立即使用，需分装冻存于-80，以防止反复冻融发生降解。

细胞裂解液中含多种组分，可以按照提取目的配制不同的裂解液，具体见下表：

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 图3 细胞裂解液中常用的组分及作用

根据样品类型或者实验目的所加入的裂解液组分及其浓度不同，这就需要进行配比上的调整。

当然，也可以购买商品化的提取试剂，这类试剂的操作简单快速，可以有效保证提取蛋白的质量。我公司目前蛋白提取试剂主要针对哺乳动物组织或细胞，详情如下：

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图4 蛋白提取试剂选择图解

组织样品需要根据要求进行剪碎或研磨，之后加入裂解液进行裂解。

另外，商品化的裂解液需要加入蛋白酶抑制剂，以防止提取过程中发生的降解或修饰。目前抑制剂产品有ProteinSafe Protease Inhibitor Cocktail (100×)，ProteinSafe Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100×)，主要区别在于是否含有EDTA；如果进行磷酸化检测，还需要加入ProteinSafe Phosphatase Inhibitor Cocktail (100×)。

蛋白浓度测定的目的在于保证不同处理样品间上样量一致，以便于分析结果。主要检测方法有以下几种：

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图5 蛋白定量常用方法比较

常用的检测方法是Braford法和BCA法，具体方法需根据实验需求进行选择。

二、 SDS-PAGE电泳

SDS-PAGE电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis）的主要原理为：十二烷基硫酸钠（SDS）具有一个极性头部和非极性尾巴，可以介入极性和非极性基团之间，从而把非极性尾巴插入到蛋白质三维结构中，极性头部可与水分子结合。在有SDS及还原剂（DTT或β-巯基乙醇）存在的情况下进行加热处理，会打开蛋白质的三维结构，从而形成一条线性分子。由于SDS在蛋白分子上的分布密度基本一致，蛋白分子表面带有的负电荷密度也是一致的；同时SDS负电荷的存在可以抵消蛋白本身所带电荷，这就保证电泳过程中的迁移速度仅与蛋白大小有关，从而使不同大小的蛋白得以分离。

聚丙烯酰胺凝胶具有一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质，用这种凝胶作为支持物的电泳，就称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶组成为：

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图6 PAGE组分及作用

聚丙烯酰胺凝胶的多孔性受到链的长度以及聚合反应过程交联的程度，即凝胶中丙烯酰胺浓度的影响。不同浓度的凝胶可以有效分离不同大小的蛋白，如下表所示。（注：丙烯酰胺:双丙烯酰胺的分子比是29:1。）

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图7 不同胶浓度分离蛋白大小

根据是否具有浓缩效应，可分为连续电泳和不连续电泳，目前使用比较多的是不连续电泳。

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图8 连接电泳和不连续电泳比较

小分子蛋白在Glycine-SDS-PAGE中可能存在两种情况：低分子量的多肽常常堆积在浓缩胶中，不能进入到分离胶中；分子量较小的蛋白常常堆积在一起，无法分离开。

第一种情况可能因为在分离胶和浓缩胶的界面上，pH值的改变导致尾随离子解离增加不足以将多肽分子带入到分离胶中。第二种情况的可能因为SDS-多肽胶束呈现为球形，而不是通常的椭圆棒状结构，其长短轴相似，导致内部电荷无法被表面SDS的电荷完全覆盖，迁移率不与大小呈线性关系，甚至分子量小于6 kDa的蛋白，都具有相同的迁移率。

对于小于30 kDa的蛋白尤其是疏水蛋白质可以考虑使用Tricine-SDS-PAGE进行检测。

根据以下几点进行膜的选择：膜与目的蛋白分子的结合能力（单位面积的膜能够结合蛋白的载量）；膜的孔径（可拦截蛋白的大小）：分子量大于20 kDa使用0.45 μm的膜，分子量小于20 kDa使用0.2 μm的膜，分子量小于7 kDa使用0.1 μm的膜；根据显色方法选择信噪比高的膜；根据不同的实验目的来选择。

目前比较常用的膜主要有NC膜和PVDF膜，二者的区别如下：

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图9 NC膜和PVDF膜比较

转膜方法主要有半干转法和湿转法，一般情况下两种方法都可以得到满意的效果。对于小分子量蛋白，用半干法转膜效果好，转膜条件建议恒流法，200 mA每平方厘米膜，转膜时间一般为15-20分钟；大分子量蛋白（如100 kDa以上），建议采用湿法转膜，可以选择恒压法，电压可以设置120-150 V，根据蛋白大小设置不同的转膜时间。

转膜后可以使用丽春红S染膜，观察蛋白转膜情况后再将丽春红洗掉，这一过程是可逆的；也可以通过观察预染Marker，检测是否存在蛋白过转或未转上的情况。

以上是本期为您介绍的内容，下期我们将继续为您介绍Western Blot技术。祝您科研顺利！

全式金技术部