上一期介绍了荧光定量PCR与普通PCR的重要差别、qPCR的两个重要参数及数学原理，接下来全式金生物继续为大家梳理定量方式和定量方法等相关内容。

qPCR定量方式

qPCR常用的定量方式有：SYBR染料法、TaqMan探针法、分子信标。

SYBR染料法利用SYBR Green I分子的特点，SYBR Green I 是一种结合于所有双链DNA（dsDNA）双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料（见图一）。

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图一

SYBR Green I 只有和双链DNA结合后才发荧光，游离的染料分子不发光，在新合成链延伸过程中SYBR Green I 掺入双链中，变性时DNA双链解开，SYBR Green I 游离出来，无荧光，过程参见图二。SYBR染料法需要注意引物的特异性，因为非特异扩增产物和引物二具体均为dsDNA，所以SYBR染料法只能通过引物来保证特异性，SYBR染料法的优点在于简单且成本较低；

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图二

TaqMan探针法核心是探针分子，TaqMan探针是单链DNA，5’端偶联发光基团，3’端偶联淬灭基团，游离的完整探针是检测不到荧光信号的，发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭，探针被水解，发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号（见图三）。

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图三 

反应开始时，模板链经热变性解链形成单链，TaqMan探针优先跟模板链退火，引物随后退火到模板上，之后进行链的延伸，延伸过程中Taq酶发挥5’-3’外切酶活性，遇到探针会从5’端逐个碱基切除探针，发光基团会跟淬灭基团分开，因此荧光检测系统可以接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的，整个过程参见图四。TaqMan探针法的特异性除了由引物提供，更由探针分子保证，因其退火温度更高，所以TaqMan探针法特异性更好，在一个反应体系中加入多条探针，可以做多个基因同时检测。

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 图四

分子信标类似于TaqMan探针，5’端偶联有发光基团，3’端偶联淬灭基团，游离的探针因互补结构存在形成发卡结构，发光基团和淬灭基团距离非常近，发光基团发出的荧光会发生荧光共振能量转移现象（FRET），激发淬灭基团后信号衰减（见图五）。

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 图五

qPCR反应开始的时候，因体系温度升高，发夹结构被破坏打开，分子信标茎环区跟模板链退火，发光基团跟淬灭基团分开，因距离较远，因此不会发生FRET，所有可以检测到荧光信号的变化，新合成链会将分子信标替换，脱离模板链的信标分子又重新形成发卡结构不再产生荧光信号，整个过程参见图六。分子信标因背景荧光极低及其高的特异性可以做SNP检测。

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图六

关于定量方式的选择，一般情况下，在科研中，绝大多数定量会选择便宜且方便的SYBR染料法，对于更严格的定量，可以选择TaqMan探针法；在医疗检验中，优先选择准确并且特异的TaqMan探针法。

除此之外以下方面可以作为参考：

SYBR染料法适用：特异性要求不是特别高的反应、分子数（拷贝数）超过1000的反应、探针实验前进行预实验、PCR条件非常成熟、无二聚体、无非特异扩增；

TaqMan探针法适用：特异性要求较高的实验、多重PCR（标记不同的荧光基团）、SNP检测、灵敏度要求较高的实验 。

一步法VS两步法

一步法和两步法qPCR的区别在于：两步法是先完成反转录，反转录引物为通用引物，后以cDNA为模板进行后续qPCR检测；一步法是直接以RNA为模板，在一个反应体系中先完成反转录，反转录引物为基因特异性引物（GSP），然后直接进行扩增，得不到cDNA，见图七。适用范围的差别在于，一步法适合单个基因多个模板检测；两步法适用于多个基因少量模板检测。

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 图七

qPCR定量方法

定量方法包括相对定量和绝对定量，两者的重要差异在于相对定量的结果是差异性的结果，涉及比较；而绝对定量的结果是一个具体数值，对于基因表达量而言是基因的拷贝数，不涉及任何比较。

 相对定量首先需要确定一个内参基因，内参基因作用有检测样本材料中RNA是否降解、纠正样本加样的差异、校正cDNA合成速率差异及校正PCR抑制剂的影响，其本质作用是利用内参基因的Ct值对目的基因的Ct值进行均一化处理，常用的内参基因包括GAPDH、β-actin、18S rRNA，使用的时候需要注意其序列必须是物种本身的特异序列，虽然其比较保守，但不同物种也会存在碱基差别。另外，相对定量需要确定参照物，因为涉及比较，参照物选择不同，所得的定量结果可能完全相反，经常选择的参照物一般是对照组或未处理组

相对定量实验方法包括两种重要方法：

1. CT Method：使用内参基因定量所研究样品和参照样品的目的基因。内参基因与目的基因可以同时反应，也可以单独反应；

2. 双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。绝对定量需要由标准曲线建立Ct值跟拷贝数之间的关系，标准曲线由标准品生成，标准品可以是已知浓度的RNA、质粒或合成的寡核苷酸链生成，定量未知模板时标准样品和未知样品必须同时反应；

 绝对定量首先需要建立Ct值和拷贝数之间的线性关系，即标准曲线，标曲需要由标准品生成，标准品中基因序列要与待测样品中基因序列一致，从而保证引物在两者中扩增效率完全相同，标准品来源可以是质粒，纯化的PCR产物或者基因组DNA等。标准品在加样时需要注意体积最好大于2微升，以减少标曲误差，标曲是由不同梯度标准品生成，每个标准品梯度建立Ct值与拷贝数对数值之间的联系，落在标曲上的梯度点最好有5个及以上，至少3个点。标准品和待测样品同时反应，将待测样品检测的Ct值代入标曲后即可换算出待测样品中基因的拷贝数。

祝大家科研顺利！