01RNA提取基本原则

RNA提取的基本原则是从目标样本中提取出完整度好、纯度高的优质RNA，主要避免在样品的保存或RNA提取过程中，RNase对RNA的降解。

02样品保存

拿到样品后如不能立刻进行提取，需要对样品进行液氮速冻，之后于-80保存；不建议直接将样本放于-20亦或是-80进行储存，由于在缓慢降温过程中，随着细胞的死亡，细胞内的溶酶体破裂，溶酶体内的RNase会释放出来使样本中的RNA降解。

03样品保护

在没有液氮的实验条件下，如野外采样等，不能对样品立刻进行速冷时，可以利用一些保护试剂如RNA hold对样品进行保存；其主要成分是非特异性蛋白酶变性剂，能够失活样本内源性的RNase，从而保护RNA的完整性。

04RNA提取方法选择

拿到样品后，需要根据样品的种属，如动物样品或植物样品；亦或是样本状态，诸如是动物组织或是动物细胞，进行提取试剂和相应提取方法的选择。

RNA提取方法包括两种：

一种是胍盐法：其能够有效裂解细胞，同时抑制RNase活性、保持RNA完整度；下游可用硅胶柱亦或是异丙醇进行RNA富集，其特点是提取量大。提取试剂如：EasyPure RNA Kit；Viral DNA/RNA Kit；Plant RNA Kit；Blood RNA Kit。

另一种是CTAB法：其在裂解细胞时能够避免多糖多酚与RNA的结合，同样下游可用硅胶柱法亦或是异丙醇进行RNA富集，其主要适用于植物样品尤其是多糖多酚类样品RNA的提取。提取试剂如TransZol Plant。

05RNA提取注意事项

• 实验人员需要穿实验服，佩戴手套和口罩亦或头套，以防止皮屑、唾液及头屑中RNase的引入；

• 提取RNA所用操作台最好是专用的，或干净的且人流量小的区域，以避免外源RNase的引入； 

• RNA提取所用耗材如EP管或枪头等需进行DEPC处理（0.1PC水浸泡过夜，高压灭菌后烘干即可使用）以失活RNase，或购买RNase-free的耗材直接使用；提取时所用的有机试剂如70%乙醇需要用RNase-free水或0.1%的高压灭菌的DEPC水进行配置；

• 用于组织研磨的研钵，使用前需要用酒精灼烧，以失活研钵可能残存的RNase；

• 提取RNA时所用的有机试剂如氯仿或异丙醇要与提DNA的分开使用，以避免外源RNase的引入；

• 整个提取过程在低温条件下快速提取，以降低RNA降解的风险。

06RNA检测

提取完RNA后需要对RNA进行检测，包括分光光度计、琼脂糖凝胶电泳及Agilent’s RNA LabChip and 2100 Bioanalyzer分析等，以检测RNA的浓度、纯度和完整度。

• 分光光度计检测：主要用于RNA的浓度及纯度测定，不能进行RNA完整度检测。其两个重要参数包括A260/280及A260/230；纯度较好的RNA，A260/280为2.0左右，如果比值小于2.0，RNA中有蛋白残留；A260/230为2.0-2.2之间，如果比值小于2.0，RNA中含有有机试剂，如酚、乙醇或糖类的残留。

• 琼脂糖凝胶检测：可以进行RNA完整度分析，但其不能对RNA实现准确定量或是否有杂质如有机试剂，如酚、乙醇或糖类的残留进行检测。最终通过RNA条带完整度来判断RNA是否降解或有基因组（gDNA）残留。

http://s4/mw690/0039crcIzy7lVivMiUHf3&690

• Agilent’s RNA LabChip and 2100 Bioanalyzer进行RNA品质分析：主要通过峰图位置及峰图高度或面积来分析RNA的完整度和浓度，同时可检测RNA中是否有基因组（gDNA）的残留；但其不能检测RNA的纯度即是否有蛋白或有机试剂污染。此检测方法成本比较高，一般适用于对RNA质量要求比较高的实验，如二代或三代测序。

上述任一方法均不能同时检测RNA的浓度、纯度及完整度，需要使用其中任意两种方法同时对RNA进行分析，以保证RNA的品质。

07基因组（gDNA）去除

如果提取的RNA有gDNA残留，需要去除gDNA以避免其对后续qPCR定量的影响，即使用DNase消化去除。

DNase活性严格依赖于Ca2+；在Ca2+存在条件下，如果反应体系中含有Mg2+，DNase会对gDNA进行随机切割，消化为小的DNA片段；如果体系中含有Mn2+，DNase会特异性识别特定位点，将gDNA消化为长度不一的DNA片段。

EDTA、 SDS、DTT/β-ME、高盐（>100 mM）等会严重影响DNase活性。

http://s9/mw690/0039crcIzy7lVixRFGMe8&690

08DNase失活

方法一：根据DNase活性严格依赖于Ca2+这一特性，可在浓度为2.5 mM EDTA条件下，将含有DNase的RNA 65加热10 min，使DNase失活。

方法二：DNase作为蛋白，可利用酚氯仿进行抽提去除。

通过上述一系列操作之后，即可得到无gDNA残留、纯度高且完整度好的RNA，以作为后续实验的底物。