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分子克隆载体如何选择?

(2014-04-30 14:26:46)
标签:

克隆载体

载体

全式金

peasy

基因

休闲

分类: 生物实验相关
    由于分子克隆载体的大小决定外源DNA插入片段的大小,两者呈反比关系,因而在建立载体时千方百计地减小载体分子量。对于穿梭载体,因为复制起点和标记基因具有生物特异性,所以载体上需要同时具有两个以上的复制起点和标记基因。

选择克隆载体的几个重要参数:

1、实验对象

2、实验性质

3、载体容量

4、 合适克隆位点

5、载体的稳定性

6、克隆载体的特点

实验对象:

1、供体:遗传背景与DNA特点等,其中包括染色体DNA大小,基因大小与结构,碱基组成,目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。

2、受体:各种中间宿主与终宿主的遗传背景,如遗传物质的传递方式(包括认为的方法),DNA限制修饰系统,DNA重组基因特点,基因产物修饰系统,即转录与翻译后修饰系统。

实验性质:

分子克隆的一般程序包括以下几步:

1、分离供体DNARNAmRNA)和载体DNA

2、构建基因文库或cDNA文库

3、目的基因或cDNA克隆的筛选

4、目的基因或cDNA片段的鉴定:限制酶谱,次克隆,核苷酸序列分析,基因结构分析等

5、基因表达与调控机理的研究

克隆载体容量:

M13mp载体    <4 kb

细菌质粒载体   <10kb

λ载体         <23kb

cos质粒载体    <48kb

P1载体         <95kb

pEASY载体      1000kb

合适的克隆位点:

单克隆位点和多克隆位点;单克隆位点的克隆载体就能够很方便的在基因上设计酶切位点,如pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆载体,双抗,无多克隆酶切位点;而多克隆位点的克隆载体中,酶切位点多,相对于实验来说也更容易。如pEASY-T1 Cloning Kit克隆载体,双抗性,酶切位点多。

克隆载体的稳定性:

克隆载体的稳定性决定着实验的成败,如果克隆载体在基因克隆过程中足够的稳定,而且能够多次的重复利用,那么此克隆载体的稳定性很好。如pEASY-T5 Zero Cloning Kit克隆载体的研发数据显示10kb目的基因可以稳定的连接。

克隆载体的特点:

    不同品牌的克隆载体或多或少都有着不同的特性差异,即使基本的原理和作用都相同,但是一些细小的差别能决定着生物实验过程的成败。如pEASY系列的克隆载体就有着5min快速克隆,克隆稳定性极强,最大的一个特点是一般的克隆载体需要在中间的实验步骤加入T4连接酶,将目的基因和载体基因序列链接在一起,而pEASY系列克隆载体属于一体式克隆载体,在载体基因的两端就附带了“胶水”,能有效的使目的基因连接到载体基因上。

 

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