CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR 系统共分成 3 类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种 CRISPR 相关蛋白（Cas 蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种 Cas 蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。

       目前，来自 Streptococcus pyogenes 的 CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割 DNA 两条单链。Cas9 首先与 crRNA 及 tracrRNA 结合成复合物，然后通过 PAM 序列结合并侵入 DNA，形成 RNA-DNA 复合结构，进而对目的 DNA 双链进行切割，使 DNA 双链断裂。

       由于 PAM 序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9 系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。

       通过基因工程手段对 crRNA 和 tracrRNA 进行改造，将其连接在一起得到 sgRNA（single guide RNA）。融合的 RNA 具有与野生型 RNA 类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达 sgRNA 的原件与表达 Cas9 的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作[2,3]。

目前常用的 CAS9 研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：

 

目前常见的 CAS9 普通质粒有（汉恒生物提供 cas9 质粒试剂盒）：

       虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用质粒见 addgene（ lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast ），慢病毒可以整合入宿主基因组中，长期稳定的表达（金开瑞生物提供 CRISPR/cas9 慢病毒包装），但是由于慢病毒克隆能力有限而 CAS9 本身分子量比较大（大于 4kb），且长期插入可能导致乱切，脱靶等，同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强，获得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想的敲除效果。（汉恒生物提供 CRISPR/cas9 腺病毒包装）