一．原理

       外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

       DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。

       连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。

二．材料与方法

1 材料

外源DNA片断

2 仪器、用具

移液枪、碎冰

3 试剂

pMD 18-T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP

4 方法

连接体系如下：

16℃连接过夜。

（二）重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定

1 材料

E.coli JM109菌株

2 仪器、用具

超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml 离心管、电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器

3 试剂

(1) CaCl2、LB平板（见附录）；SOC培养基（见附录）；SOB培养基

(2) RNase A1；Buffer S1；Buffer S2；Buffer S3；Buffer W1；无水乙醇的Buffer W2a

(3) 1×电泳缓冲液（TAE）；溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心]；琼脂糖；6×加样缓冲液

(4) 酚；氯仿；异戊醇

(5) ddH2O；10×PCR Buffer (Mg2+ plus)；dNTP；M13+；M13-；TaKaRa rTaq酶

4 方法

1. 大肠杆菌感受态细胞的制备

(1) 取大肠杆菌JM109保存液50μl，接种于4ml LB（或SOB）液体培养基中，37℃，300rpm振荡培养过夜，第二天取50μl 转接到新的4ml LB（或SOB）液体培养基中扩大培养3h至OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1ml菌液于1.5ml离心管中，冰浴10min。

(2) 4℃，5000rpm离心2min，去上清液。

(3) 加入750μl预冷的0.1M CaCl2重悬菌体，冰浴30min。

(4) 4℃，5000rpm离心2min，弃上清液。

(5) 加入100μl 冰冷的0.1M CaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2h后，4℃保存备用。

2. 重组DNA的转化

(1) 将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃预热。

(2) 于100μl感受态细胞中加入10μl连接产物，冰浴30min。

(3) 将离心管转入42℃水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2min。

(4) 在离心管中加入SOC培养基300μl，枪头混匀，37℃、150rpm温和摇振60min。

(5) 将200μl 转化菌液均匀地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、200mg/ml IPTG 的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。

注意事项：

① 制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。

② 42℃热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。

③ 菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。

3． 重组质粒的鉴定

方案一 菌落PCR

(1) 制备PCR混合液：

(2) 用经灭菌的10μl枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中

(3) 盖上离心管得盖子，在沸水上温育10 min。

(4) 将步骤 ⑶ 的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25ul。

(5) 按以下条件进行PCR反应：94℃预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条

件为：94℃变性1min，57℃退火1min，72 ℃延伸1min；循环结束后72℃再延伸5min。

(6) 取5μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

方案二 质粒PCR

1. 碱裂解法少量制备质粒DNA

(1) 用离心管收集4ml在LB培养基（含Amp）中培养过夜的菌液，14000rpm离心30秒，弃尽上清。

(2) 用250μl已加入RNase A1的Buffer S1充分悬浮细菌沉淀。

(3) 加入250μl Buffer S2，温和但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5min。

*Buffer S2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。

(4) 加入400μl Buffer S3，温和地上下翻转8-10次，室温静置2min，14000rpm离心10min。

*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g离心3min。

(5) 将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，将步⑷中的混合液移入DNA-prep Tube中，5500rpm离心1min。

(6) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500μl Buffer W1，5500rpm离心1min。

(7) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入700μl已加无水乙醇的Buffer W2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的Buffer

W2洗涤一次。

(8) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，14000rpm离心1min。

(9) 连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prep Tube 置于一新的1.5ml 离心管中，在silica 膜

中央加入25-30μl Eluent或去离子水。

(10) 室温静置2 min，14000rpm离心1min洗脱DNA。

(11) 取5μL样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。

2. 抽提纯化质粒DNA酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒DNA中残留的蛋白质。

(1) 加TE稀释质粒DNA溶液至300μL。

(2) 加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），震荡混匀，静置3min。

(3) 14000rpm 离心5min，吸上清液，加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），混匀，静置3min。

(4) 14000rpm离心5min，吸上清液，加等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混匀，静置3min。

(5) 14000rpm离心5min，吸上清液，加2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置15min，沉淀质粒DNA。

(6) 14000rpm离心13min，弃上清液，沉淀加入200μL 70%乙醇洗涤一次，室温干燥，用20μL去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀，-20℃保存待用。

(7) 取5μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。

3. 质粒PCR

(1) PCR反应体系如下：

(2) PCR 扩增反应条件：94℃预变性3min；然后进行30 个循环反应，其温度循环条件为：

94℃变性1min，57℃退火1min，72 ℃延伸1min；循环结束后72℃再延伸5min。

(3) 取5μl PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。 

       PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。

       平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。

       粘头连接也可以大致分为两类，一类粘头连接是用某种方法，在载体和PCR产物上产生长的可互补的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5’端加入一段某种限制酶的识别序列。如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列，就可以做到定向连接。另一类利用部分PCR产物3’端带有一个凸出的dAMP的特性，构建3’端带有凸出的dTMP的载体。一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在70℃或72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。如果使用ddTTP，效果会更好。这种方法一般称为加T/A法克隆，比平头连接效率高50～100倍。

1. TA克隆构建原理：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。

2.操作步骤

⑴ 连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。

⑵ 10μl体积反应体系如下：

①取T载体1μl (50ng)，加入等摩尔数PCR产物 。

②加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH2O 补足至10μl 。

⑶ 稍加离心，通常为14-16℃水浴连接8-14hr，或4℃过夜。

⑷ 转染，蓝白斑筛选同前。

1.要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。

2.PCR产物在TA克隆前要通过纯化。

3.在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。 

PCR产物的TA克隆

       通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。由于在PCR过程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分为2种情况：（1）使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A，因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟，然后将加A产物直接用于TA连接。

        pMD 18-T Vector是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning)的专用载体。它是TaKaRa独自研究开发，由pUC18载体改建而成的。在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I 和Sal I识别位点之间插入了EcoR V 识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3'端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个“A”的特性,所以使用本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。本制品是以最为常用的pUC18载体为基础研制而成，所以它具有同pUC18载体完全相同的功能。此外，本制品中的高效连接液Ligation Solution I 可以在极短的时间内 (30分钟-1小时)完成连接反应，大大地方便了实验操作。另外，本制品中还含有Control Insert (500 bp)，可用于Control反应。

用途：克隆PCR产物。对克隆后的PCR产物用M13 Primers进行DNA测序。

       α互补和蓝白筛选的原理：许多载体（包括pMD18-T）都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子和编码其N端氨基酸（α肽链）的片断基因。宿主具有编码β半乳糖苷酶的C端基因。当二者产物组合在一起，就具有活性酶的产生，此现象称为α互补。由α互补形成的具有功能活性的β半乳糖苷酶,可以用X-gal显色测定出来，它能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和蓝色底物。当外源DNA片断插入到多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽链，而导致不能形成功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色的，而没有插入外源片断的则是蓝色的。

试剂

pMD 18-T Vector试剂盒，或自己PCR扩增回收纯化的片段，T4DNA链接酶。IPTG，X-gal，LB培养基等。

200mg/ml的IPTG 过滤除菌

20mg/ml的X—gal 溶于二甲基甲酰胺，避光保存。

操作步骤

1. 在微型离心管中制备下述连接反应液，全量为10 ml。

    pMD 18-T Vector 1ml*

      control insert DNA 1ml*

      H20                       3ml

      ligation solution I    5ul

进行实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要使用适量的T载体。

2.  取0.5 l16℃反应30分钟 (过夜反应也不影响连接效率)。

3. 全量 (10ml) 转化至JM109感受态细胞 (100l)中。

4. 在含有40ml 20mg/ml的X-Gal、4ml 200mg/ml 的IPTG、50-100mg/ml Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

5. 挑选白色菌落，使用PCR法确认T载体中插入片段的长度大小。

注意事项：

1. Ligation Solution I 请于冰中融解。

2. 在进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1: 2 ~ 10。在本制品中， pMD18-T Vector1 ml (50 ng) 的摩尔数约为0.03 pmol，Control Insert DNA 1ml (50 ng) 的摩尔数约为0.15pmol。

3. 克隆时使用的Insert DNA片段 (PCR 产物) 尽量进行切胶回收纯化，PCR产物中的短片段DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。

4. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 ml。当进行转化的DNA用量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。

5. 连接反应请在16℃下进行，温度升高 (>26℃) 较难形成环状DNA。

6. 连接效率偏低时，可适当延长连接时间至数小时。

7. 感受态细胞可使用适合于pUC系列载体的感受态细胞，如：JM109，DH5a等。

怎样提高pMD18-T Vector的克隆效率?

1. 纯化PCR产物。切胶回收的PCR片段最好

2. 除去残存的引物等杂质。

3. DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段DNA的克隆效率（连接效率与转化效率）小于短片段DNA，在使用大片段DNA的连接液进行转化时，建议采用电转化方法。

PCR产物难以插入载体，为什么?

1. 确认PCR反应使用的DNA聚合酶在PCR产物的3'端是否附加了"A"。有些DNA聚合酶扩增的PCR产物是平端,如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005)等扩增得到的PCR产物不能直接用于TA克隆；PCR产物保存时间不要过长, 长时间保存的PCR产物会脱去末端的"A"碱基。

2. PCR产物中短片段杂质DNA太多，这时应切胶回收纯化DNA片段，回收时PCR产物不要在紫外线下暴露时间过长。

3. 确认感受态细胞的转化效率，使用的感受态细胞的转化效率最好大于108 cfu/mg pUC118 DNA。

4. 确认Ligation Solution I 的连接效率是否降低，多次反复冻融会降低的Ligation Solution I 连接效率。

5. 确认抗生素的浓度是否过大。

6. 最好使用新配制的平板培养基。

转化后的菌落全为蓝色 (或淡蓝色)，为什么?

插入的PCR片段较短（小于500 bp)，且插入片段没有影响lacZ基因的读框时，平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色。

插入的PCR产物进行测序时，可使用何种引物?

本制品的载体来源于pUC18载体。因此，用于pUC18载体测序的引物都可以使用。