CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是新出现的一种由sgRNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。在这一系统中，sgRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA 进行修饰的目的。

　　虽然有很多CRISPR–Cas系统需要多种蛋白的参与，但是在很多细菌的胞内都只需要一种内切酶（endonuclease）——Cas9就足够了，我们将这种CRISPR–Cas系统也称作2型系统（type II systems）。

　　Cas9内切酶在向导RNA的指引下能够对各种入侵的外源DNA分子进行定点切割，不过主要识别的还是保守的间隔相邻基序（proto-spacer adjacent motifs，PAM基序）。如果要形成一个有功能的DNA切割复合体，还需要另外两个RNA分子的帮助，它们就是CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA（trans -acting CRISPR RNA, tracrRNA)。crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。不过最近有研究发现，这两种RNA可以被“改装”成一个向导RNA（single-guide RNA, sgRNA）。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。最新的报道称，在多种类型的细胞和生物体内，这种RNA介导的Cas9酶切作用能够正常地行使功能，在完整基因组上的特定位点完成切割反应。这样就可以方便地进行后续的基因组改造工作了。

　　细胞通常会通过两种方式对发生双链断裂的DNA进行修复，这两种方式分别是同源重组修复机制（homologous recombination, HR）和非同源末端连接修复机制（non-homologous end joining, NHEJ），不过在修复的过程中细胞有可能会对修复位点进行修饰，或者插入新的遗传信息。

　　为满足不同实验需求，金开瑞现推出CRISPR/Cas9技术服务，可根据您的需要量身定制您专属的CRISPR/Cas9载体，包括pCas9/gRNA1 载体和pCas9/gRNA3 载体，并可利用pCas9/gRNA1或pCas9/gRNA3 载体进行基因敲除服务。

　　（1）pCas9/gRNA1 载体可在哺乳动物细胞内同时表达人源化 Cas9 蛋白和 gRNA，只需转染一个质粒就能实现对靶基因的切割。

Cas9对DNA切割示意图

pCas9/gRNA1 载体

　  （2）pCas9/gRNA3 载体可在哺乳动物细胞内同时表达人源化 Cas9Nickase 蛋白和 gRNA。

　　Cas9Nicknase 是 Cas9 蛋白的 D10A 突变体，切割 DNA 单链。由于 DNA 上的 Nick 缺口会很快被细胞修复，一般不会造成基因突变。 Cas9Nicknase 需要成对的 gRNA 辅助才能实现 DNA 双链断裂。采用 Nicknase 蛋白可以提高基因敲除的特异性，但是对 gRNA 的设计要求较高。敲除效率也比 Cas9 蛋白低一些。简单地说， Cas9 基因敲除效率更高，操作更容易； Cas9Nicknase 特异性更高。

Cas9Nicknase对DNA切割示意图

pCas9/gRNA3 载体