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(2017-10-24 10:56:21)
标签：
非编码rnaincrnamirnatrfs |
分类： 研究方案 |
长链非编码RNA（long noncoding
RNA，lncRNA）是一类长度＞200bp的RNA，由RNA聚合酶Ⅱ转录，lncRNA具有保守的二级结构,大部分不编码蛋白质。LncRNA发挥功能的方式很广，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控。主要包括基因组表观遗传修饰、调控转录后翻译、发挥ceRNA、增强子RNA作用等，从而对细胞的增殖、分化、迁移、凋亡、免疫等发挥调控作用。
金开瑞提供的非编码RNA技术服务：miRNA、lncRNA、tRFs
研究方案（以lncRNA为例）
1、采用二代测序或芯片技术找出不同组样本差异表达的lncRNA
图1. LncRNA 差异表达聚类结果及差异表达火山图
2、lncRNA/miRNA筛选验证
采用RT-PCR或者qRT-PCR检测lncRNA/miRNA在不同组织和细胞中的表达水平。
图2. PVT1和 miRNA在宫颈癌组织中的表达
(Iden, M.et al.The lncRNA PVT1
Contributes to the Cervical Cancer Phenotype and Associates with
Poor Patient Prognosis.PloS one.2016.May 27;11(5))
3、细胞系鉴定
采用对肝癌细胞（如hepG2、hep3b、huh7）STR位点和Amelogenin位点的基因分型技术，进行细胞鉴定。
4、lncRNA功能及下游靶标分子研究
4.1、构建lncRNA/miRNA的过表达（基因敲除）稳转癌细胞株；
图3. 基因过表达/敲除后单克隆细胞株的筛选
图4. CRISPR/Cas9和慢病毒稳定细胞系
4.2、MTT/CCK8法测定细胞生长活力；
图5. 转染TP53TG1 减少了细胞的活力
（Diaz-Lagares A, et al.Epigenetic
inactivation of the p53-induced long noncoding RNA TP53 target 1 in
human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov
22;113(47):E7535-E7544.）
4.3、流式细胞检测细胞凋亡；
图6. HCT-116 cells 稳定转染TP53TG1
24小时后检测细胞的凋亡率
（Diaz-Lagares A, et al.Epigenetic
inactivation of the p53-induced long noncoding RNA TP53 target 1 in
human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov
22;113(47):E7535-E7544.）
4.4、软琼脂克隆形成实验；
图7. TP53TG1
抑制了HCT-116细胞的克隆形成
（Diaz-Lagares A, et al.Epigenetic
inactivation of the p53-induced long noncoding RNA TP53 target 1 in
human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov
22;113(47):E7535-E7544.）
4.5、细胞划痕实验；
图8. 伤痕愈合实验检测 VIM
敲低和过表达对细胞侵袭力的影响
（Peng Zheng,Quantitative
Proteomics Analysis Reveals Novel Insights into Mechanisms of
Action of Long Non-coding RNA HOTAIR in Hela Cells.MCP.
2015.）
4.6、细胞体外Matrigel侵袭实验；
图9.
与siCONT细胞相比，siPVT1细胞侵袭力明显降低
(Iden, M.et al.The lncRNA PVT1
Contributes to the Cervical Cancer Phenotype and Associates with
Poor Patient Prognosis.PloS one.2016.May 27;11(5))
4.7、Western blot检测肿瘤相关蛋白表达。
图10. 用不同浓度的EW-7197 (0.25, 0.5,
1.25 and 2.5 μM) 处理A549-CUG2 and BEAS-CUG2 细胞24 h。免疫印迹检测 CUG2,
E-cadherin, N-cadherin, and vimentin 的表达
（Kaowinn S, Kim J, Lee J, Shin DH,
et, al. Cancer upregulated gene 2 induces epithelial-mesenchymal
transition of human lung cancer cells via TGF-β signaling.
Oncotarget. 2016 Dec
5、蛋白质组学寻找调控的下游靶标分子
应用蛋白质组学iTRAQ（SILAC,SWATH）定量方法和生物信息学找到lncRNA/miRNA调控的靶标。
图11. 蛋白质组学ITRAQ/SWATH
和差异蛋白通路分析
6、采用FISH技术研究lncRNA在细胞中定位分布
图12.
目的lncRNA在细胞中的位置分布（18S和U6为内参）
7、lncRNA作用机制研究
7.1、采用体外转录技术，RNA pull down, LC- MS等技术手段检测与RNA互作的蛋白质。
图13. RNA pull down后质谱鉴定、WB检测
7.2、RIP验证与蛋白质结合的lncRNA或者lncRNA与miRNA的互作
图14. AP-1蛋白与RNA的相互作用RIP
图15. MS2-
RIP实验原理图（表达Lnc-A的质粒富集miRNA1miRNA2的效率比不表达Lnc-A的MS2组明显提高。通过对照，说明MS2-A可以与miRNA1和miRNA2相互结合）
7.3、双荧光素酶基因检测miRNA和lncRNA/mRNA的互作情况
生物信息学预测分析
图16.
利用生物信息学方法预测lncRNA与miRNA的结合位点
双荧光素酶和RIP验证
图17.
双荧光素酶和RIP验证lncRNA可以与miR-26a结合
（C Cao, Zhang T, Zhang D, et
al.The long non-coding RNA, SNHG6-003, functions as a competing
endogenous RNA to promote the progression of hepatocellular
carcinoma. Oncogene. 2017 Feb 23;36(8):1112-1122. ）
8、动物实验
8.1、成瘤模型
图18.
肝癌裸鼠成瘤模型，通过活体成像和测量观察不同处理小鼠肿瘤的生长、转移情况
（C Cao, Zhang T, Zhang D, et
al.The long non-coding RNA, SNHG6-003, functions as a competing
endogenous RNA to promote the progression of hepatocellular
carcinoma. Oncogene. 2017 Feb 23;36(8):1112-1122. ）
8.2、普通药物模型或基因治疗模型
8.3、模式动物：CRISPR/Cas9敲除或敲入的模式动物
图19.
腺病毒注射小鼠尾静脉后，隔一段时间通过肺组织切片观察某基因对肺的影响
8.4、损伤修复模型
如骨断裂恢复模型
图20.
小鼠骨断裂后用SEC2处理，X-ray拍摄结果显示SEC2组小鼠恢复更快
(Xu J, Wu T, Sun Y, et
al.Staphylococcal Enterotoxin C2 Expedites Bone Consolidation in
Distraction Osteogenesis. J Orthop Res. 2017 Jun;35(6):1215-1225.
)
参考文献：
1、Budhu A, Forgues M, Ye QH, et al. Prediction of venous
metastases, recurrence, and prognosis in hepatocellular carcinoma
based on a unique immune response signature of the liver
microenvironment. Cancer Cell. 2006 Aug;10(2):99-111.
2、Fidler IJ. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed
and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 2003
Jun;3(6):453-8.
3、Ocaña OH, Córcoles R, Fabra A, et al. Metastatic
colonization requires the repression of the epithelial-mesenchymal
transition inducer Prrx1. Cancer Cell. 2012 Dec
11;22(6):709-24.
4、Massagué J. TGFbeta in Cancer. Cell. 2008 Jul
25;134(2):215-30.
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