奶牛体细胞数控制

                                         P.L. Ruegg 和 J.C.F. Pantoja 译者：孙忠军

在很多发达国家，乳房炎是奶牛最为常见的传染病，并导致奶牛场和乳品加工厂巨大的经济损失(Fetrow等，2000;Halasa等，2007;Geary等，2012)。因为乳房炎的感染部位是乳腺，其经济影响比大多数其它传染病都大;乳腺感染还使得乳腺的泌乳能力降低以及牛奶的加工价值降低(Barbano等，2006)。乳腺感染引起的炎症能导致临床和/或亚临床症状，其控制措施必须包含检测和监测该病两种发病形式的方法(Ruegg 2011)。

　　将乳房炎的发病率降到最低和持续生产优质的牛奶是对那些想要在全球市场保持竞争力的奶牛场的一个要求。牛奶体细胞计数很久以来就被用作衡量牛奶质量的一种工具(Dohoo等，1991)。罐奶体细胞数(BTSCC)一般被国家和国际上用于制定牛奶卫生质量的管理标准。欧盟、澳大利亚、新西兰和加拿大的国家标准是小于40万/毫升，而巴西的标准是小于100万/毫升(USDA , 2013)。然而，国际贸易对牛奶质量的要求变得比国家标准更重要。美国就是一个很好的例子，即使缺乏严格的国家标准，市场力量也能使得罐奶体细胞数得到快速改善。尽管美国一些州的标准比较严格，但大多数州的法定标准仍是75万/毫升(FDA 2011)。然而，美国牛奶制品的出口在增加。2012年美国出口的牛奶制品占生产总量的13.2%，其中包括大约45%～47%的乳清蛋白和脱脂奶粉或非脂干奶(美国乳品出口协会2013)。为了保证美国的奶制品能够进入欧盟，美国农业部引入了一个管理项目，允许加工厂获得一个出口证明以确认在牧场水平已经采用了欧盟40万/毫升的牛奶体细胞数标准。经过行业内的不断努力，尽管国家标准没有变化，但罐奶体细胞数在持续下降(见图1，USDA 2013)。这些改善说明奶牛场为了应对市场的需求能够生产优质牛奶，也暗示加工厂有足够的措施刺激奶牛场采用新的管理措施以提高其牛场质量。

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图1：美国罐奶体细胞数的变化趋势

　　罐奶体细胞数常被用来衡量牛群的牛奶质量，但仍有必要测量个体奶牛的牛奶体细胞数以估测隐性乳房炎的发病率和流行率。在多数情况下，对DHI参数中的体细胞数进行月度评估以监测牛群和个体奶牛乳腺感染的动态变化(Laevens等，1997;Ruegg，2003)。该月度报告可以用来监测牛群和个体奶牛的体细胞数变化，发现隐性感染的奶牛，并决定是否采取行牛奶培养、隔离、治疗或淘汰等措施(Cook等，2002;Rhoda等，2012)。加入DHI检测项目对于管理奶牛乳房健康很有必要，并能有效降低牛群中隐性乳房炎的流行率(Wilson等，1997)。本文的目的在于评估牛奶体细胞数作为一种诊断工具来提高奶牛场的牛奶质量。

　　乳腺感染和炎症的检测

　　乳房炎的科学定义是“乳腺内的炎症反应”，但在实践中，大多数奶牛乳房炎都是细菌感染引起的，即使有些病例是酵母菌、真菌或藻类感染引起的(Hogan等，1999)。乳房炎发生的初期是由一定数量的病原菌经过乳导管进入乳腺，然后经过一段潜伏期的生长繁殖，然后根据与奶牛免疫反应的斗争结果出现痊愈、隐性还是临床乳房炎(Ovideo-Boyso等，2007)。乳房炎在感染发生的过程中其实是检测不到的，但可以通过其引起的炎症来识别。因此，乳房炎的出现(隐性或临床病例)取决于病原菌和奶牛的特点，后者影响奶牛免疫反应的程度;而牛场人员对乳房炎的识别取决于检测方法的强度和精确度(Ruegg等，发表中)。

　　样品采集的稳定性对于体细胞数的检测非常重要，因为用于检测的那一部分样品可能影响体细胞数的检测结果。通常来说，挤奶的初期和后期，体细胞数最高，而挤奶中间阶段(出奶高峰期)牛奶的体细胞数最低(Urech等，1999;Bansal等，2005;Nielson等，2005;Sarikaya等，2006)。挤奶的间隔时间也影响体细胞数的昼夜变化(Reneau，1986)。研究还发现傍晚采集的牛奶样品比早晨采集的牛奶样品中体细胞数要高(Reneau，1986)。尽管对体细胞数昼夜变化的忽略可能不会影响对主要病原菌的诊断，但可能导致诊断方面的误差。

　　根据定义，来自隐性感染乳区的牛奶外观基本正常(即使含有几百万/毫升的体细胞)，但包含大量的体细胞(有或没有可检测到的病原菌)(Dohoo等，1991)。牛奶中的体细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、以及很小比例的上皮细胞(Sordillo等，1997)。来自健康乳区的牛奶体细胞数通常远低于10万/毫升，主要为巨噬细胞(Hamann，2005)。发生乳腺感染后，炎症介质使得大量的噬菌细胞从血液进入到乳腺内，使得牛奶体细胞数急剧增加，细胞分布也从巨噬细胞为主转变为以中性粒细胞为主。

　　隐性乳房炎的检测主要是对来自单个乳区的奶样或个体奶牛所有乳区的混合奶样进行体细胞数测量。DHI项目通常使用从挤奶机中采取的混合奶样来监测个体奶牛的体细胞数。重要的是要认识到每个乳区是被单独感染，且多数感染只发生在单个乳区内。如果使用混合奶样，由于健康乳区中的体细胞数很低而使得混合奶样中的体细胞数得到稀释，一些隐性乳房炎可能就会检测不到(图2)(Ruegg等，2002;Ruegg，2011)。

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图2：检测混合奶样体细胞数的示例说明

　　乳区水平，乳腺感染与体细胞数的关系最为密切(Schukken等，2003)。研究发现，未感染乳区的体细胞数平均为7万/毫升;一旦体细胞数超过10万/毫升，泌乳量就会减少(Schukken等，2003)。健康乳区内的体细胞数都比较低，一般都在10万/毫升以下(Hamann，2005)，体细胞数小于20万/毫升通常被认为是评价一个乳区是否健康最为现实的一个基准值(Dohoo等，1991;Schepers等，1997;Djabari等，2002;Pantoja等，2009)。随着体细胞数超过20万/毫升，牛奶中分离到主要病原菌的概率就会增加。当使用体细胞数来检测乳腺是否受到感染，20～25万/毫升之间的一个基准值被认为能减少生产环境中的诊断误差(Dohoo等，1991;Schepers等，1997;Djabri等，2002)。

　　选择定义隐性乳房炎合适的基准值取决于管理项目的目标。当您的目标是检测微生物学阳性的乳区，较低的基准值将会发现更多乳腺感染的奶牛(敏感性增加，假阴性减少);如果选择较高的基准值(特异性增加)，将减少假阳性的情况(Pantoja等，2009)。不管选择什么基准，评价一头奶牛的体细胞数变化史比观察单个月份的体细胞数更有意义。

　　体细胞数超过20万/毫升是乳腺感染非常具有特异性的指标，乳区体细胞数很高但没有分离到病原菌并不代表这个乳区健康。微生物学阴性但体细胞数增加是一种常见的情形，这可能是由于免疫反应导致细菌数量低于实验室可检测的下限以下(一般为100菌落形成单位/毫升)。体细胞数增加是免疫反应的一部分，其目的在于清除病原菌。这种反应通常是有效的，体细胞数超过20万/毫升的乳区至少有10%～25%的比例为细菌学阴性(Dohoo等，1991;Schepers等，1997;Pantoja等，2009)。当使用体细胞数的月度表来识别潜在的受感染奶牛，对于阴性乳房炎感染率不太高的牛群，分离到细菌的阳性预测值(PPV)相对较差。在最近的研究中，阳性预测值(定义为从首次测试体细胞数超过20万/毫升的奶样中分离到乳房炎病原菌的概率)仅仅为41%(Pantoja等，2009)。与此对照的是，阴性预测值(NPV，定义为从首次测试体细胞数少于20万/毫升的奶样中不能分离到乳房炎病原菌的概率)为85%。这说明牛场主应该认识到许多用来分离乳房炎病原的奶样可能呈阴性，单个奶样的检测结果对于感染状态或治疗效果都不能做出过度解读。经过有效的治疗或自愈，体细胞数会慢慢恢复到20万/以下，但恢复到正常所需要的时间长短取决于不同的病因(de Haas等，2004;Ruegg，2013)。

　　个体奶牛的体细胞数并不是呈现正常的分布状态，一个牛群的算术平均值可能不能代表牛群乳腺感染的流行情况。为了解决偏态分布的问题，很多北美的DHI中心使用一种线性评分(通常定义为体细胞数评分SCS)来报告体细胞数，通常用一个简单的公式来计算(LS=log2(SCC/100)+3)。使用体细胞数评分可以消除个别非常高的数值的影响，并与产奶量呈线性缩减。如果使用体细胞评分，体细胞评分每增加一个单位，头胎牛和经产牛的产奶量将分别损失91公斤和182公斤(Ali和Shook，1980)。

　　临床乳房炎

　　临床乳房炎的定义为炎症反应所导致的眼观的异常奶，不论体细胞数水平如何。卫生条例通常要求异常奶必须予以废弃(FDA 2011)，因此如果临床病例都能准确识别，那么临床乳房炎的发生对罐奶体细胞数的水平不会有什么影响。然而，大多数临床乳房炎病例都相对比较温和，除非在套杯前仔细观察前几把奶否则发现不了。在威斯康辛51个奶牛场共计接近800例临床乳房炎的研究发现，只有15%的病例出现系统性症状，而50%的病例只出现牛奶异常和35%的病例出现牛奶异常和乳区肿胀(Oliveira等，2013)。

　　有关乳腺感染隐性阶段和临床阶段之间的关系取决于致病因(Sheldrake等，1983;Smith等，1985;Schepers等，1997)。许多革兰氏阳性菌引起的乳腺感染在临床阶段出现以前会有很长的隐性阶段，而革兰氏阴性菌引起的感染与革兰氏阳性菌相比隐性阶段比较短(Smith等，1985;de Haas等，2002)。过去的研究对临床症状出现前和出现后的病原特异性体细胞变化模式进行了评估(de Haas等，2002;2004)。在革兰氏阳性病原菌(金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和其它链球菌)有关的临床乳房炎出现前有一段体细胞数增加的隐性阶段，而在大肠杆菌引起的临床乳房炎出现前体细胞数一般都小于20万/毫升(de Haas等，2004)。为了了解病原菌所引起的乳腺感染和临床乳房炎的情况，对不论是否痊愈的病例其体细胞数增加的时间长短进行了分析。在临床症状痊愈后，与大肠杆菌有关的感染或没有分离到病原菌的病例，牛奶体细胞数会很快恢复到正常水平;而金黄色葡萄球菌或凝固酶阴性葡萄球菌引起的感染恢复较慢，泌乳期内体细胞数较高。与此对比的是，链球菌引起的体细胞数增加没有呈现出任何有规律的变化模式(de Haas等，2004)。使用体细胞数水平不能检测临床乳房炎，但对临床症状出现前的体细胞数变化历史进行分析能够对潜在的病因和是否需要抗菌治疗提供有用的线索(Ruegg，2013)。例如，在发病前有体细胞数长时间增加历史的一个临床病例与炎症出现前没有体细胞数增加历史的病例相比，更有可能是由细菌感染引起并且需要抗菌治疗。

　　影响牛奶体细胞数水平的因素

　　奶牛产犊后，牛奶体细胞数通常大于10万/毫升，在产后7～10天降低到10万/毫升左右。Barkema等(1999)报道细菌培养阴性的新产奶牛的体细胞数的几何平均数从产后第一天的58.8万/毫升下降到产后第三天的16.6万/毫升。过了泌乳初期，如果没有乳腺感染，很少有白细胞会进入牛奶，体细胞数一般小于10万/毫升。随着泌乳期的延长，牛奶体细胞数和中性粒细胞的比例也逐渐增加。即使没有明显的乳腺感染，泌乳末期非常低产的奶牛的体细胞数也会增加，但在DHI最后一个测试日产奶量超过4公斤以上的奶牛体细胞数的增加并不显著(Bodoh等，1976)。因此，在大多数现代牧场，泌乳末期体细胞数的增加并不是乳腺感染的一个指标。泌乳不同阶段牛奶体细胞数的特异性增加能够反映特定牧场奶牛接触病原菌的情况。接触传染性病原菌和环境性病原菌所导致的乳腺感染的发生时间和持续长短通常来说很有特点。比如，牛群中有很多奶牛感染接触传染性病原菌，乳腺感染的流行率会随着泌乳期和胎次的增加而增加，因为健康奶牛从隐性感染的同伴那里接触这些病原菌的机会也增加。与此对比的是，由环境性病原菌导致的乳腺感染的发生率(以体细胞数增加为据)通常在泌乳早期最高，因为奶牛产后的免疫抑制降低了动物机体对这些机会性病原菌的反应能力。

　　年龄、乳腺中受感染的乳区数量(混合奶样)、季节、昼夜变化都是影响体细胞数变化的重要因素(Dohoo等，1982;Wiggans等，1987;Schepers等，1997)。随着胎次的增加，奶牛出现乳腺感染的概率就越大，体细胞数也会增加，主要是因为乳腺感染的流行率增加和动物机体对特定病原菌的细胞反应更加剧烈。正如预想的，如果检测混合奶样，如果受感染的乳区数量增加，牛奶中的体细胞数也增加。牛奶中体细胞数随季节变化而变化在北美和欧洲都有一致的报道(Ruegg等，2000;Berry等，2006;Summer等，2007;Cicconi-Hogan等，2013)。通常，湿热天气由于奶牛接触到病原菌的机会增加(天气情况有利于细菌的生长)，乳腺感染的比例也增加;反之，寒冷季节乳腺感染的比例也减少(Ruegg等，2000;Berry等，2006;Summer等，2007;Cicconi-Hogan等，2013)。更多的研究证据表明热应激会降低中性粒细胞的噬菌能力，导致奶牛对乳腺感染的免疫能力降低(do Amaral等，2011)。因此，在湿热季节，奶牛接触到病原菌的概率增加而自身清除病菌的能力降低，导致奶牛乳腺遭受持续感染的概率增加，牛奶体细胞数也增加。

　　对单个乳区、个体奶牛和某个牛群水平而言，乳腺感染的发生是影响牛奶体细胞数的最重要因素(Dohoo等，1082)。乳区是由主要病原菌(金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌)还是次要病原菌(棒状杆菌属和凝固酶阴性的葡萄球菌)会观察到不同的体细胞反应模式。使用不管是回溯性还是前瞻性研究方法以及不同的分析单位(乳区或奶牛)的几项研究都发现，与主要病原菌相比，次要病原菌所引起的体细胞反应强度都较小。感染次要病原菌的奶牛混合奶样的体细胞数在19万/毫升至51.9万/毫升之间(平均为22.7万/毫升);而感染主要病原菌的奶牛体细胞数都高于60万/毫升(Sheldrake等，1983;Barkema等，1999;Schukken等，2003)。在奶牛水平，研究发现不同的病原菌在感染后导致特定的体细胞反应模式。试验性感染大肠杆菌的奶牛所引发的体细胞高峰期较短(攻毒后大约两天时间，而恢复到正常水平需要三到四周(Erskine，1992;Pyorala等，1994)。然而，接种金黄色葡萄球菌后24小时内体细胞数增加，至少48天都维持在较高水平(Shoshani等，2000)。(未完待续)

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